摘要為研究猴樟CbP5CS1蛋白的序列結構和功能，以猴樟轉錄組數據為基礎，采用PCR技術克隆猴樟CbP5CS1基因CDS序列，構建表達載體。結果表明，克隆得到的序列具有一個2163bp完整的ORF框，編碼720個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR86140.1基因序列一致性達98.47%，GenBank登錄號為MW813958;生物信息學分析結果表明，CbP5CS1蛋白化學分子式為34355609963105022，相對分子量77.91kD，理論等電點6.16，結構穩定，無明顯無序化特征，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點有95個;CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族結構域，具備δ吡咯啉羧酸合成酶的功能，在樟屬植物中具有較高的保守性;CbP5CS1蛋白亞細胞定位預測為細胞質，為跨膜蛋白，但不存在信號肽;重組質粒用XbaI酶切后，獲得兩條帶片段，與預期的2226bp和11516bp的大小一致，表明目的基因已經成功插入并連接到植物表達載體pCAMBIA1301上。

　　關鍵詞猴樟;CbP5CS1;基因克隆;表達載體

　　猴樟CinnamomunbodinieriLevl.)為樟科樟屬常綠喬木，主要分布于中國南方地區，是中國重要的精油加工樹種、綠化樹種和林用樹種。近年來的研究表明，猴樟的生長速度和抗寒性優于香樟，猴樟比普通香樟具備更強的耐鹽堿脅迫能力，堿脅迫下猴樟體內的脯氨酸明顯高于普通香樟，脯氨酸在猴樟耐堿脅迫過程中起重要作用韓浩章等,2019)。植物體內的脯氨酸含量對環境變化敏感，在櫸樹韓浩章等2021)、銀杏孫聰聰等2017)、白沙蒿王麗等2018)上的研究結果也表明，鹽堿脅迫條件下植物體內的脯氨酸含量會大大提高，抗性強的樹種中含有更高的脯氨酸含量。

　　外源施用脯氨酸能夠促進植物光合能力和水分利用能力(Noreenetal.,2018;Waeletal.,2020)，還能通過誘導紫花苜蓿抗氧化酶活性提高抗鹽堿脅迫能力鄧鳳飛等2016)。Igarashi等(1997)研究表明，鹽脅迫下水稻抗鹽品種的δ吡咯啉羧酸合成酶OsP5CS基因表達量和脯氨酸積累量均增加，而鹽敏感品種中兩者變化不明顯。過量表達脯氨酸合成途徑的關鍵酶P5CS會導致植物體內脯氨酸的積累(Mattiolietal.,2008)，研究P5CS蛋白理化特性，構建超表達載體，能為進一步研究脯氨酸在猴樟耐堿脅迫過程中的作用機理提供依據。

　　1結果與分析

　　1.1猴樟CbP5CS1基因的克隆以猴樟的cDNA為模板，通過PCR擴增得到一條約2000bp左右的條帶，片段大小與預期一致，通過測序得到長2226bp的CDS序列。

　　PCR產物送公司測序，測序結果與沉水樟中收錄的RWR86140.1基因進行比對，序列一致性高達98.47%，具備脯氨酸合成酶的活性。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBIBLASTProtein與數據庫進行比對，根據比對結果顯示，所克隆得到的序列具有一個2163bp完整的ORF框，推導編碼720個氨基酸，將獲得的目的基因命名為CbP5CS1，獲得GenBank登錄號為MW813958。

　　1.2猴樟

　　CbP5CS1蛋白的生物信息學分析

　　1.2.1猴樟

　　CbP5CS1蛋白的理化性質分析利用Protparam軟件對猴樟CbP5CS1蛋白的理化性質進行分析，猴樟CbP5CS1蛋白相對分子量77.91kDa，理論等電點6.16，表明CbP5CS1基因編碼蛋白為弱酸性，化學分子式為34355609963105022，原子總數為11079，不穩定指數值為29.24，不穩定系數大于40時為不穩定蛋白，因而該蛋白質是穩定的。CbP5CS1蛋白脂溶指數為106.83，脂肪族氨基酸比例(28%)高于芳香族氨基酸(5%)，為脂溶性蛋白，其中帶負電荷的殘基(asp+glu)總數為91，帶正電荷的殘基(arg+lys)總數為82。

　　CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族結構域，具備P5CS的功能。利用ProtScale(web.expasy.org/protscale/)對猴樟CbP5CS1蛋白的親水性進行分析圖，得出總平均親水性值(GRAVY)為0.008。通常認為，蛋白序列中氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強，猴樟CbP5CS1氨基酸序列中第73位氨基酸分值最低為2.589，親水性值最強;第411位氨基酸分值最高，為2.789，疏水性最強，親水性氨基酸均勻分布在整個多膚鏈中，沒有明顯的疏水性區域，因此，推測猴樟CbP5CS1蛋白為親水性蛋白。

　　1.2.2猴樟

　　CbP5CS1蛋白二、三級結構預測根據PRABI(npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl)在線軟件預測結果圖，該蛋白的組成為46.67%無規則卷曲、33.33%α螺旋和20.00%延伸鏈，因而猴樟CbP5CS1蛋白可能具備較復雜的功能，其穩定性主要依賴于氫鍵。利用FoldIndex預測猴樟CbP5CS1蛋白序列折疊無序化圖，分析得出該蛋白無序化比例為2.5%，存在個氨基酸無序化結構域，這兩個結構域可能具備特殊的功能。

　　利用NetPhos3.1預測猴樟CbP5CS1蛋白磷酸化位點圖，分析得出該多肽鏈包含60個絲氨酸(S)、29個蘇氨酸(T)和個酪氨酸(Y)磷酸化位點，該蛋白可能主要通過蛋白激酶發生磷酸化。利用SwissModel(www.Swissmodel.expasy.org)進行CbP5CS1蛋白三級結構預測分析，利用SwissModel同源建模圖，經過比對CbP5CS1編碼蛋白三級結構與PDB：6rtr.1.A的氨基酸序列一致性達61%，6rtr.1.A序列的編碼蛋白為SemialdehydedehydrogenasePcd(半醛脫氫酶。

　　1.2.3猴樟

　　CbP5CS1蛋白亞細胞定位與跨膜結構預測利用CellPLoc2.0在線分析軟件(www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/CellPLo2/)和LocTree3在線分析軟件進行猴樟CbP5CS1蛋白的亞細胞定位預測，結果表明該蛋白定位于細胞質。利用TMpred(www.expasy.org/resources/tmpred)預測猴樟CbP5CS1蛋白跨膜結構圖，分析得出該蛋白在93~113aa、248~264aa處各有一個從內到外的跨膜螺旋，其中心位點為105aa和256aa處。

　　在54~73aa、248~267aa、421~440aa處各有一個從外到內的跨膜螺旋，其中心位點為65、256、431aa處;其中248~264aa處從內到外的跨膜螺旋和248~267aa處從外到內的跨膜螺旋分值超過500，具有生物學意義，推測可能是跨膜蛋白。利用SignalP5.0Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測圖，分析得出該蛋白Sec/SPⅠ型信號肽概率為0.084%，即猴樟CbP5CS1蛋白中極大可能不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。

　　1.3pCAMBIA1301

　　CbP5CS1表達載體構建及酶切驗證將pCAMBIA1301空載體和含有CbP5CS1基因的載體質粒分別用NcoI和BglII雙酶切，回收具有相同酶切位點的目的條帶和載體，之后，將連接產物pCAMBIA1301CbP5CS1轉化到DH5α感受態細胞，菌液PCR篩選陽性克隆提取質粒后進行序列測定，測序比對正確的質粒用XbaI酶切該基因不含XbaI酶切位點，但在載體插入位置兩端各有一個XbaI酶切位點，因此選擇XbaI酶切驗證載體中是否正確插入了目的基因，用XbaI酶切后，獲得兩條帶片段，一條約2300bp，一條帶約11000bp左右，與預期的2226bp和11516bp的大小一致圖，酶切結果表明目的基因已經成功插入并連接到植物表達載體pCAMBIA1301上。

　　2討論

　　脯氨酸不僅是植物體內重要的滲透調節物質，還與光合作用、呼吸作用密切相關，其合成場所為細胞質和葉綠體，分解場所為線粒體丁澤紅等2016)。在滲透脅迫和氮素不足情況下，植物體內脯氨酸的合成以谷氨酸途徑為主，P5CS是脯氨酸谷氨酸合成途徑中的關鍵限速酶王紅艷2016)，P5CS基因的表達特性對研究脯氨酸在植物響應逆境脅迫過程中的作用機理非常重要。Hu等(1992)首次從豇豆中克隆得到高等植物P5CS基因，該基因全長2417bp，包含單一開放閱讀框，編碼一個73.2kD多肽。

　　之后，研究者陸續從木薯付莉莉等2016)、擬南芥王翠平和華學軍2017)、甜菜張皓等2019)、鹽角草郝曉燕等2021)中克隆了P5CS基因，并對其耐鹽特性及其編碼的蛋白結構進行了分析，認為P5CS的蛋白結構在不同物種之間并不一致，但基本功能是一致的。本試驗以猴樟cDNA為模版克隆的P5CS基因片段，具有一個2163bp完整的ORF框，編碼720個氨基酸序列，與沉水樟P5CS蛋白序列同源性為98.47%。通過MEGA7.0軟件構建CbP5CS1蛋白系統進化樹的結果表明，猴樟CbP5CS1蛋白在進化上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類，說明其親緣關系最近，樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。

　　利用NCBI的CCD工具進行蛋白結構域預測結果表明，CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族結構域，具備δ吡咯啉羧酸合成酶的功能。CbP5CS1蛋白相對分子量77.91kD，理論等電點6.16，化學分子式為34355609963105022，結構穩定、無明顯無序化特征，為脂溶性、親水性蛋白，與周利霞等(2019)結果一致。CbP5CS1蛋白多肽鏈中0.500以上分值的磷酸化氨基酸位點為95個，而磷酸化作用在植物信號轉導、生長發育以及抗逆脅迫等方面發揮重要作用，說明P5CS的功能與逆境脅迫有關(Mogamietal.,2015)。

　　CbP5CS1蛋白的亞細胞定位預測為細胞質，很可能為跨膜蛋白，但信號肽預測分析得出該蛋白極大可能不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。本實驗將獲得的重組質粒用XbaI酶切后，獲得兩條帶片段，一條約2300bp，一條帶約12000bp左右，與預期的2226bp和11516bp的大小一致，酶切結果表明目的基因已經成功插入并連接到植物表達載體pCAMBIA1301上，為進一步通過轉基因技術研究脯氨酸代謝在猴樟耐鹽堿脅迫中的作用提供支持。

　　3材料與方法

　　3.1試驗材料

　　試驗材料為耐鹽堿猴樟品系標注為HJHZ)3年生種苗，于2018年月上旬播種，2020年月上旬進行種苗表型鑒定與標記，同時移入鹽堿土壤環境試驗區進行栽培，株行距均為1.5。試驗區土壤pH值8.17，電導率153μS/cm，可溶性鹽含量15.89mg/g。于2020年月20日，取猴樟枝條頂部幼嫩葉片進行液氮速凍后，用RNAperpPurePlantKit(天根,北京試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa,大連方法去除基因組DNA后，用TRPrimeMix(andomprimer)進行反轉錄反應，獲得的cDNA產物作為模板。

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　　3.2基因克隆

　　根據猴樟轉錄組數據，獲得具備P5CS蛋白功能的CDS序列，將其命名為CbP5CS1，使用PrimerPremier5.0軟件設計擴增引物，PCR反應體系參照CloneUFOTMOneStepCloningKIT說明書，采用25μL體系：2×ProofastTMMasterMix12.5μL、10μmol上下游引物各1μL、模板0.6μL，用ddH補齊至25μL。PCR反應條件為：95℃預變性180s;95℃變性10，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環;72℃延伸480s。PCR產物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離，之后，使用DpnⅠ(2n/50μL擴增產物消化后進行重組反應，反應產物直接轉化大腸桿菌Escherichiacoli)DH5α感受態細胞(TSINGKE,北京，挑單菌落進行PCR鑒定，將PCR陽性菌落培養后，提取質粒送擎科生物技術有限公司測序。

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　　作者：韓浩章張麗華李素華趙榮王芳王曉立蔣亞華