摘要鐵觀音是高香茶樹品種的選育親本骨干，具有品種獨特的“觀音韻”，其鮮葉加工成烏龍茶，香氣馥郁持久;萜類合成酶(TPS)是茶樹萜類化合物合成過程中的關鍵酶，在茶葉香氣的形成中起到關鍵作用。為探究茶樹TPS基因家族的潛在功能，利用生物信息學方法及熒光定量PCR技術，對茶樹TPS基因家族進行了鑒定及表達分析。生物信息學分析結果表明，從茶樹鐵觀音基因組中鑒定出48條TPS基因，分別命名為CsTPS1-CsTPS48，均含有N末端結構域和C端金屬離子結合結構域。系統進化樹顯示，CsTPS基因家族分為5個亞家族，為TPS-a、TPS-b、TPS-g、TPS-c和TPS-e/f。相同亞家族的CsTPS基因外顯子-內含子數目基本一致。上游啟動子區域分析發現大量與植物發育、激素和脅迫響應相關的順式作用元件。轉錄組數據分析表明，CsTPS基因在茶樹特定發育時期發揮重要作用。熒光定量檢測發現，CsTPS3、CsTPS23、CsTPS25、CsTPS29和CsTPS30在MeJA處理下的表達量顯著上調;CsTPS3在GA處理下的表達量顯著上調;CsTPS29和CsTPS30在低溫和干旱處理下表達量顯著上升。綜上所述，CsTPS基因在茶葉香氣的形成中發揮重要作用，并且與茶樹生長發育、激素和脅迫響應緊密相關;結果可為進一步探究茶樹TPS基因家族的功能及在茶葉香氣形成中的作用提供參考。

　　關鍵詞茶樹;萜類合成酶;系統進化;脅迫;表達分析

　　萜類化合物是植物重要的次生代謝物，具有揮發性和芳香味，賦予植物特殊的香氣。同時對傳粉、植物防御、調節植物生長發育等方面產生重要影響[1]。次生代謝物中的萜類化合物有倍半萜(sesquiterpenes，C15)、單萜(monoterpenes，C10)、二萜(diterpenes，C20)、三萜(triterpenes，C30)等。萜類合成酶(terpenesynthase,TPS)在植物萜類物質合成的關鍵酶。TPS家族系統分為7個亞家族，分別為TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h，其中TPS-a主要合成倍半萜合酶，TPS-b和TPS-g主要合成單萜合酶，TPS-c和TPS-e/f主要合成二萜合酶[2]。

　　此外，Pfam(http://pfam.xfam.org/)數據庫顯示，TPS有兩個保守域，分別為N末端結構域(PF01397)和C端金屬離子結合結構域(PF03936)[3]。TPS還具有RRX8W、RXR、DDXXD、NSE/DTE基序等保守的結構特征。萜烯類代謝途徑與茶葉香氣形成密切相關[4]。特別是揮發性單萜和倍半萜，單萜中的香葉醇(玫瑰花香)和芳樟醇(木清香和花香)等，以及倍半萜中的橙花叔醇(橙花香)和α-法尼稀(花香)等，在茶葉香氣組分中占據重要地位[5]。

　　目前，課題組已對茶樹萜烯類代謝途徑中的相關基因進行了克隆或鑒定等相關研究，如二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(CsMVD)、甲羥戊酸激酶基因(CsMVK)、單萜合成酶(CsTPS)和萜類合成相關基因[6-9]。近些年來，TPS基因已在多個物種得到鑒定，如擬南芥、番茄、煙草、中�？Х�、水稻、葡萄、茶樹等[10-16]。鐵觀音(Camelliasinensis„Tie-guanyin‟)因其制茶品質優異，已成為高香茶樹品種尤其是烏龍茶品種的選育親本骨干，鐵觀音制作的烏龍茶，沖泡后具有天然的蘭花香，香氣馥郁持久，滋味醇厚而甘甜，具有品種獨特的“觀音韻”。前人通過茶樹轉錄組數據鑒定出80個CsTPS基因，并參與激素和非生物脅迫應答[16]。但有關茶樹品種鐵觀音TPS基因家族的鑒定及表達分析還未見報道。

　　因此，本研究在全基因組水平對茶樹TPS基因家族進行鑒定，利用生物信息學分析CsTPS基因家族及其在6個組織中的表達模式。通過熒光定量PCR檢測研究CsTPS基因家族在MeJA、GA、低溫和干旱處理過程下的表達模式，以期為探究茶樹TPS基因家族的功能及在香氣形成中的作用提供參考。

　　1材料與方法

　　1.1材料處理以國家級優良茶樹品種„鐵觀音‟為試驗材料，將環境溫度下的茶樹分別進行低溫(4℃)和干旱(10%PEG-6000溶液)處理。用新鮮配制的100μmol/LMeJA、GA溶液進行激素處理。收集MeJA、GA激素處理0(對照)、6、12、24、48h和4℃、PEG處理0(對照)、24、48h后的第二葉。每個設置3次生物學重復，錫箔紙包裹標記，液氮固樣后保存于–80℃冰箱備用。

　　1.2茶樹TPS基因家族成員的鑒定從茶樹鐵觀音基因組數據庫中下載蛋白序列，在Pfam(http://pfam.xfam.org/)數據庫中下載PF01397和PF03936的隱馬爾可夫模型，利用HMMER軟件搜索茶樹TPS基因家族的候選序列，去除掉只含有一個結構域的基因，得到同時含PF01397和PF03936這兩個結構域的基因序列，并在CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMARAT(http://smart.embl-heidelberg.de)網站進行結構域驗證，去除不完整的序列，得到具有全長蛋白序列的TPS家族成員序列。利用ExPASy(http://www.expasy.org)網站對茶樹TPS蛋白的理化性質進行分析。利用WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)網站進行亞細胞定位預測。

　　1.3茶樹TPS基因家族系統進化樹構建和基因結構分析整理擬南芥[10]和番茄[11]中已鑒定出的TPS基因序列，從NCBI蛋白數據庫下載對應TPS序列，用軟件MEGA軟件構建系統進化樹，校驗參數Bootstrap值設置為1000。在GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)網站分析茶樹TPS基因結構[17]。

　　茶樹TPS基因家族序列比對和保守基序分析用WebLogo(https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)網站和DNAMAN軟件對CsTPS基因家族的保守序列進行分析。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)網址預測保守基序，設置基序最大數目為15。使用TBtools軟件[18]可視化茶樹TPS基因在染色體上的位置。

　　茶樹TPS基因啟動子順式元件分析用TBtools軟件提取CsTPS基因轉錄起始位點上游2000bp的序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網站進行順式元件預測分析[19]。

　　茶樹TPS基因組織特異性表達分析下載鐵觀音茶樹的轉錄組數據，參照前人方法計算獲得CsTPS基因在芽、幼葉、老葉、莖和根的FPKM值[20]，使用TBtools軟件[18]制作熱圖。

　　實時熒光定量PCR分析通過Primer3plus(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)網站設計熒光定量引物。以CsGAPDH作為內參基因。參照前人方法合成cDNA作為實時熒光定量PCR模板[21]。熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應：94℃30s;94℃5s，60℃30s，40個循環，反應體系使用Transstart®TipGreenqPCRsuperMix試劑盒的方法。用2-ΔΔCt算法計算基因相對表達水平[22]，用prism軟件統計基因表達水平，用SPSS軟件進行顯著性分析。

　　2結果與分析

　　2.1茶樹TPS基因家族的鑒定與序列分析通過鑒定最終得到48條TPS基因家族成員序列，并按照所在染色體位置分別命名為CsTPS1到CsTPS48。CsTPS基因編碼序列為1002-2664bp，編碼氨基酸數目為333-887。CsTPS家族的分子量在38.93-102.19kDa，等電點為4.6-6.66，CsTPS蛋白的等電點小于7，表明該家族基因為酸性蛋白。CsTPS均為親水性蛋白。亞細胞定位發現大部分CsTPS定位于細胞質(25個)和葉綠體(17個)，5個CsTPS定位于細胞核，其中僅1個CsTPS定位于線粒體。

　　2.2CsTPS基因家族系統發育和基因結構分析

　　構建茶樹與擬南芥及番茄的系統進化樹。分析結果表明，CsTPS分為5個亞家族，其中TPS-a有16個成員，TPS-b有19個成員，TPS-g、TPS-e/f和TPS-c分別有6、5和2個成員。TPS-a和TPS-b這兩個亞家族較大，包含了72.9%的CsTPS成員。這與只用CsTPS構建的進化樹的分類結果一致。

　　CsTPS基因家族的基因結構圖顯示，CsTPS5基因組序列最長，超過37000bp。TPS-a亞家族所含外顯子數目除CsTPS2(12個)、CsTPS1(4個)和CsTPS16(4個)外，CsTPS基因所含外顯子數目為6-9個;TPS-b亞家族外顯子數目為6-8個;TPS-e/f亞家族所含外顯子較多有11-13個;TPS-c亞家族中的CsTPS18和CsTPS40分別有6和15個外顯子，差異較大;TPS-g亞家族外顯子數目為7-9個�？梢钥闯觯�相同亞家族的CsTPS基因通常外顯子-內含子結構也相似。

　　2.3CsTPS家族基因功能預測用NCBI的BLASTP將CsTPS蛋白序列與已知功能植物的萜類合成酶蛋白序列進行比較(E 90)，預測CsTPS基因可能存在的功能。其中，單萜合成酶：2個芳樟醇合成酶;倍半萜合成酶：10個大根香葉烯合成酶，8個α-法尼烯合成酶，2個橙花叔醇合成酶;雙功能萜類合成酶：3個芳樟醇/橙花叔醇合成酶;二萜合成酶：3個香葉基芳樟醇合成酶，1個貝殼杉烯合成酶，1個柯巴基焦磷酸合酶�？梢钥闯�，CsTPS基因主要編碼合成倍半萜合成酶。

　　2.4CsTPS家族染色體定位對茶樹TPS基因染色體進行定位分析發現，CsTPS1和CsTPS2定位在1號染色體上，CsTPS3和CsTPS4定位在2號染色體上，CsTPS47和CsTPS48定位在14號染色體上，CsTPS40定位在11號染色體上，CsTPS41定位在12號染色體上，5個基因(CsTPS15、CsTPS36-CsTPS39)定位在10號染色體，5個基因(CsTPS42-CsTPS46)定位在13號染色體，有6個基因(CsTPS5-CsTPS10)定位在5號染色體上，10個基因(CsTPS11-CsTPS20)定位在7號染色體上，14個基因(CsTPS21-CsTPS34)定位在8號染色體上。其中，24個CsTPS基因分布在7號和8號染色體上�？梢钥闯�，CsTPS基因主要以串聯重復的方式分布在染色體上。

　　3討論與結論

　　不同植物的TPS基因家族數量存在顯著差異，在被子植物中，TPS基因數量大約在40-152個[2]。前人通過轉錄組數據在舒茶早中共鑒定出23個具有完整編碼序列的CsTPS基因[16]。而本研究在鐵觀音基因組中檢索同時含有PF01397和PF03936且具有全長序列的基因，共鑒定出48個CsTPS基因，是舒茶早中CsTPS基因數目的2倍左右。另外，本研究對CsTPS基因進行了系統的生物信息學分析。系統發育分析表明，CsTPS基因家族可分為5個TPS亞家族，其中TPS-b是CsTPS家族中最大的亞家族，其次是TPS-a，這與舒茶早、擬南芥和番茄等研究結果相反[10,16,25]。

　　另外，前人沒有對舒茶早進行染色體定位分析[16]，而本研究通過分析發現TPS基因不均勻地分布在10條染色體上，且以串聯重復的形式出現，說明茶樹TPS基因在進化過程中發生了基因復制擴增[25]。這與中�？Х群头�茄的研究結果相似[13,25]�；�因外顯子-內含子結構在一定程度上反映了基因結構與功能的差異[24]。本研究中，相同亞家族的CsTPS基因外顯子數量基本一致，與舒茶早、擬南芥及番茄TPS家族的基因結構分布相符[10,16,25]。已有研究表明，在舒茶早、農抗早和擬南芥中分別發現23、11和32個功能性TPS基因[10.16,26]。在本研究中，預測出32個功能性CsTPS基因，分別編碼不同的萜類合成酶。

　　在舒茶早中，花或葉中大量表達的CsTPS基因被注釋為倍半萜合酶基因[16]。這與本研究預測出的CsTPS基因功能相符，大部分為倍半萜合成酶。本研究中預測的TPS-g中5個CsTPS基因可能編碼雙功能芳樟醇/橙花醇合成酶和橙花叔醇合成酶，這與舒茶早、番茄、楊樹中TPS-g中TPS基因已注釋的功能相同[11,16,27]。

　　另外，本研究預測出2個CsTPS基因可能編碼芳樟醇合成酶。有研究發現CsTPS基因殺青前表達量達到鮮葉的3.8倍，搖青后的做青葉具有典型的蘭花香，推斷該基因與烏龍茶香氣品質的形成有關[8]。橙花叔醇、芳樟醇等具花果香的香氣物質是烏龍茶香氣的主要成分[4]。這暗示了鐵觀音加工成烏龍茶后香氣馥郁持久可能與橙花叔醇、芳樟醇等化合物有關。

　　農藝師論文投稿刊物：《茶葉科學技術》(季刊)創刊于1960年，是福建省農業科學院茶葉研究所主辦的茶葉科技綜合性學術期刊。主要報道茶樹栽培、茶樹育種、茶園土壤肥料、茶葉機械、茶葉加工、茶樹生理生化、茶樹植保與茶葉經濟等領域的新成果、新技術、新品種、新工藝與科學種茶、制茶經驗、經營管理經驗以及應用理論等。

　　在舒茶早中，CsTPS70被注釋為貝殼杉烯合酶[16]。且擬南芥中的AtTPSGA1和AtTPSGA2分別編碼柯巴基焦磷酸合酶和貝殼杉烯合酶，共同參與赤霉素的合成[10]。這暗示本研究中的CsTPS11和CsTPS40可能參與了茶樹體內赤霉素的合成。已有研究證明擬南芥和楊樹中TPS-f中的AtTPS4和PtTPS10被推測為二萜合成酶，能夠將GGPP轉化為香葉基芳樟醇[10,27]。本研究預測發現TPS-e/f中的CsTPS26、CsTPS31、CsTPS33可能編碼香葉基芳樟醇合成酶。本研究預測的CsTPS基因是基于與已知功能的植物萜類合成酶同源基因序列的分析，具有較高的序列比對跨度和相似度[26]。但這些基因的化學功能仍需后續試驗逐一驗證。

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　　作者：高婷鄭玉成王鵬杰谷夢雅陳雪津洪雅萍侯炳豪葉乃興