摘要：目的基于高通量測序獲得藥用資源植物密花香薷Elsholtziadensa葉綠體基因組序列，分析了葉綠體基因組結(jié)構(gòu)及特征，為研究密花香薷資源分類及系統(tǒng)進化奠定了基礎(chǔ)。方法以密花香薷葉片為材料，利用改良的CTAB法提取DNA;采用二代測序技術(shù)IlluminaNovaSeq平臺對葉綠體基因組進行測序;以廣藿香葉綠體基因組為參考序列，進行序列組裝和矯正，得到完整葉綠體基因組序列;利用生物信息學(xué)方法分析密花香薷葉綠體基因組特征并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果獲得密花香薷完整葉綠體基因組序列全長149095bp，GC含量37.92%，注釋到130個基因，其中包括85個蛋白質(zhì)編碼基因，8個rRNA基因和37個tRNA基因;密花香薷葉綠體基因組中共檢測到28個散在重復(fù)序列，串聯(lián)重復(fù)序列共檢測到191個，單核苷酸重復(fù)序列最多，共114個;系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，密花香薷和其他唇形科植物聚合在一起形成一個分支結(jié)構(gòu)，紫蘇屬植物和香薷屬植物親緣關(guān)系較近。結(jié)論建立了適于香薷屬植物葉綠體基因組測序及其特征分析的方法，豐富了唇形科植物遺傳資源，為密花香薷分子標記開發(fā)及唇形科屬種間系統(tǒng)發(fā)育分析研究提供了理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：密花香薷;葉綠體;基因組;分子標記;系統(tǒng)發(fā)育

　　葉綠體是綠色植物特有細胞器，是細胞能量轉(zhuǎn)換和儲存的場所，遺傳方式以母系為主，所以在植物中具有種的特異性，其自身擁有一套完整的基因組，重組率低，后代遺傳穩(wěn)定[1-2]。葉綠體基因組在被子植物中具有獨立的蛋白表達系統(tǒng)，大小介于1.20×105～1.80×105bp，一般為共價閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)由4部分組成：包含2個反向重復(fù)區(qū)(invertedrepeats，IRs)、大單拷貝區(qū)(largesinglecopy，LSC)和小單拷貝區(qū)(smallsinglecopy，SSC)4個部分[3]。

　　葉綠體基因組相比核基因組包含信息量較小，由于進化模式和分布區(qū)域的差異，不同類群物種間基因組有時會發(fā)生插入/缺失、重復(fù)、倒位、重排等多種類型的結(jié)構(gòu)變異和基因丟失現(xiàn)象，但是，從組成結(jié)構(gòu)、基因類型和數(shù)目及排列順序來看，葉綠體基因組較穩(wěn)定，具有保守性，長度較小，易于測序，而且葉綠體基因組核苷酸進化速率較低，因此在植物不同分類階段的系統(tǒng)發(fā)育分析中具有廣發(fā)的應(yīng)用，葉綠體基因組和其CDS基因片段變異分析常被用于分析物種種群遺傳結(jié)構(gòu)分化及動態(tài)歷史發(fā)展規(guī)律[4-7]。

　　煙草NicotianatabacumL.[8]和地錢MarchantiapolymorphaL.[9]2個物種葉綠體基因組測序報道，是人類首次獲得綠色植物葉綠體基因組序列信息。二代測序技術(shù)的不斷完善和推廣，為植物葉綠體基因組相關(guān)研究提供了技術(shù)支持，為后續(xù)植物資源分類和鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、譜系地理學(xué)、及野生植物資源利用和保護方面的研究提供了有效的途徑[10-12]。

　　密花香薷ElsholtziadensaBenth.在中國西北地區(qū)，如陜西、四川、云南、甘肅、青海、西藏等地廣泛分布，其外觀形態(tài)和紫蘇接近，所以又稱之為野紫蘇，屬唇形科(Labiatae)香薷屬ElsholtziaL.一年生草本植物，生境多樣化，農(nóng)田、林緣、高山、草地邊緣、林下、河邊、荒地等海拔1800～4200m的范圍內(nèi)均有分布[13-14]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，密花香薷全草可入藥，具有發(fā)汗解暑、行水散濕、溫胃調(diào)中的功效，且據(jù)現(xiàn)代藥理研究，香薷類植物揮發(fā)油具有廣譜抗菌和殺菌作用，并有直接抑制流感病毒的作用[15-16]。密花香薷亦可作為蜜源，養(yǎng)蜂價值極高[17]。所以密花香薷具有重要的藥用和經(jīng)濟價值。

　　目前，有關(guān)密花香薷生藥學(xué)或化學(xué)成分提取和分離相關(guān)研究較多[16,18-24]，蜜腺的解刨學(xué)結(jié)構(gòu)研究比較古老[25]，但關(guān)于密花香薷資源分類、居群分布規(guī)律、生理特性，尤其是分子生物學(xué)方面的相關(guān)研究還無人涉及。本研究以分布在青藏高原的密花香薷為材料，使用二代測序技術(shù)獲得密花香薷葉綠體全基因組序列信息，利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件，分析其葉綠體基因組構(gòu)成和特征，不僅可豐富唇形科植物遺傳信息，也為后續(xù)密花香薷資源分類和鑒定、遺傳多樣性、種群歷史動態(tài)發(fā)展和香薷屬植物間的系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。

　　1材料

　　用于本研究的密花香薷樣本，采于青海省共和縣青海湖二郎劍景區(qū)(N100.4911°，E36.5785°，海拔3194m)，采取生長狀況良好的幼嫩葉片，液氮冷存，帶回青海民族大學(xué)于−80℃冷凍保存，用于DNA提取。植物憑證樣本保存于青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院(FGE20197201)。

　　2方法

　　2.1全基因組DNA提取及測序

　　經(jīng)典CTAB法用于樣品DNA提取，瓊脂糖凝膠電泳判斷樣本DNA的完整性，微量核酸測定儀(NanoDrop2000)檢測其質(zhì)量和DNA含量。若樣品基因組DNA檢測結(jié)果符合實驗要求，對基因組DNA進行片段化處理，用到的方法一般為機械打斷法即超聲波法，下一步是對片段化DNA進行純化和末端修復(fù)，還需在3′端加A、連接測序接頭，對上述處理完的DNA片段需進行片段長度分選，最后進行PCR擴增構(gòu)建測序文庫，對測序完成的文庫需進行質(zhì)量檢測，質(zhì)檢合格的文庫用IlluminaNovaSeq平臺進行測序，測序讀長為PE150。

　　為確保序列組裝過程中的準確性，必須對原始獲得的rawreads序列進行一系列處理，主要是去除測序時連接的接頭以及擴增時的引物序列;篩選出高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量(質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個read的50%以上的reads)。通過前期處理和質(zhì)量控制之后最終獲得高質(zhì)量的cleandata。

　　使用bowtie2v2.2.4比對南京集思慧遠公司自建的葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫，將比對上的測序序列當作樣品的葉綠體基因組測序序列(cpDNA序列)。組裝核心模塊采用SPAdesv3.10.1軟件組裝葉綠體基因組，組裝不依賴參考基因組。使用SPAdes軟件對上述cleanreads進行基因組拼接，將拼接結(jié)果與PogostemoncablinBenth.葉綠體基因組(MF287372.1)進行blast比對，基因組比對參考序列，查看基因組的保守與重排等共線性分析;基因組比對參考序列結(jié)構(gòu)信息，比較兩者間的差異。

　　2.2葉綠體基因組注釋和基因分析

　　使用blastv2.2.25軟件比對NCBI數(shù)據(jù)庫的葉綠體基因組cds序列，手工校正后得到葉綠體基因組基因注釋結(jié)果。使用hmmerv3.1b2軟件比對NCBI數(shù)據(jù)庫葉綠體基因組rRNA序列，得到葉綠體基因組的rRNA注釋信息。使用aragornv1.2.38軟件對葉綠體基因組序列進行tRNA的預(yù)測，得到葉綠體基因組tRNA注釋信息。最后使用OGDRAW制作葉綠體基因組完整圖譜。利用CodonW1.4.2軟件對密花香薷葉綠體基因組密碼子偏好性(RSCU，relativesynonymouscodonusage)進行分析和統(tǒng)計。

　　2.3散在重復(fù)序列及cpSSR

　　分析葉綠體基因組中的重復(fù)序列根據(jù)不同的分布模式分為2種類型即散在重復(fù)序列和串聯(lián)重復(fù)序列，散在重復(fù)序列多是失活的轉(zhuǎn)座元件，在基因組中呈分散式分布，簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeats，SSR)標記，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。使用vmatchv2.3.0軟件鑒定散在重復(fù)序列。葉綠體基因組中含有不同重復(fù)類型的串聯(lián)重復(fù)序列，一般稱之為稱之為cpSSR。

　　使用MISAv1.0(MIcroSAtelliteidentificationtool)軟件進行cpSSR的分析，參數(shù)1-8(單堿基重復(fù)8次及以上)、2-5、3-3、4-3、5-3、6-3，2個SSR序列之間的最小距離設(shè)置為100bp。

　　2.4基于葉綠體基因組序列系統(tǒng)進化分析

　　搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，選取已公開的唇形科，不同屬植物共18種[虎尾紫蘇Perillafrutescensvar.hirtellaMakinoetNemoto(KT220691.1)、檸檬紫蘇P.citriodoraNakai(KT220690.1)、P.setoyensisG.Honda(KT220692.1);海州香薷E.splendensNakaiexF.Maekawa(MH700782.1);OcimumtenuiflorumL.(NC043873.1)、羅勒O.basilicumL.(NC035143.1);丹參SalviamiltiorrhizaBge.(JX312195.1)、鼠尾草S.japonicaThunb.(NC035233);夏枯草PrunellavulgarisL.(NC039654.1);掌葉青蘭DracocephalumpalmatumC.Y.Wu(NC031874.1);留蘭香MenthaspicateL.(NC037247.1)、歐薄荷M.longifoliaL.(NC032054.1)、黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi(MF521633.1)、S.insignisNakai(NC028533.1);廣霍香P.cablinBenth.(MF287372.1);棉毛水蘇StachysbyzantinaC.KochNC029825.1)、林地水蘇S.sylvaticaL.(NC029824.1、紅花水蘇S.coccineaJacq.(NC029823.1)，下載其序列，以茄科的黑果枸杞LyciumruthenicumMurr.(NC039651.1)為外類群。

　　3結(jié)果與分析

　　3.1葉綠體基因組結(jié)構(gòu)基本特征

　　密花香薷葉綠體基因組經(jīng)測序，去掉低質(zhì)量reads后得到cleanreads22864493個片段，Q20為96.91%，GC含量為39.64%[26]。GC含量也可反應(yīng)葉綠體基因組組成特征，本研究檢測到密花香薷葉綠體基因組GC含量37.92%，遠低于AT含量(62.08%)，說明具有綠色植物葉綠體基因組普遍AT偏向性的特征[26]。

　　其中IR區(qū)序列包含有4個編碼rRNA的基因，所以GC含量(43.16%)明顯高于LSC區(qū)(35.96%)和SSC區(qū)(31.92%)[26]。使用SPAdes軟件進行基因組片段的拼接，拼接完成的序列與參考序列(accession：MF287372.1)比對，進行組裝完成后的質(zhì)量檢控。最終得到密花香薷葉綠體基因組，全長149095bp，其結(jié)構(gòu)與大多數(shù)被子植物相同，為環(huán)狀雙鏈分子，呈典型的四段式結(jié)構(gòu)(圖1)。其中，LSC結(jié)構(gòu)區(qū)長度為81497bp，SSC結(jié)構(gòu)區(qū)長度為17364bp，2個反向互補重復(fù)區(qū)IR分別長25117bp[26]。

　　3.2基因注釋及歸類分析

　　密花香薷葉綠體基因組共檢測到129個基因，其中包括84個蛋白質(zhì)編碼基因，8個rRNA基因和37個tRNA基因。其中有17個基因在IRs區(qū)重復(fù)，包含6個蛋白編碼基因(ndhB、rpl2、rpl23、rps12、rps7、ycf2)，4個rRNAs基因(rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5)7個tRNA基因(trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC);SSC區(qū)包括12個蛋白編碼基因，1個tRNA基因;LSC區(qū)包含60個蛋白編碼基因，22個tRNA基因。

　　密花香薷葉綠體基因組中大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因由1個外顯子組成，共有15個基因(atpF、ndhA、ndhB、petB、petD、rpl2、rpl16、rpoC1、trnA-UGC、trnG-UCC、trnH-GUG、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC)包含1個內(nèi)含子，3個基因(rps12、clpP、ycf3)包含2個內(nèi)含子。編碼基因根據(jù)其產(chǎn)物功能的不同分為以下幾種類型：(1)光合作用相關(guān)基因;(2)自身翻譯相關(guān)基因;(3)其他基因;(4)未知功能相關(guān)基因。

　　3.3葉綠體基因組密碼子偏好性分析

　　對密花香薷葉綠體密碼子研究發(fā)現(xiàn)，共檢測到26160個密碼子，其中編碼亮氨酸(Leu)的密碼子數(shù)量最多，有3397個，占總密碼子數(shù)的12.99%;編碼半胱氨酸Cys的最少，有299個，占總密碼子數(shù)的1.15%。相對同義密碼子(relativesynonymouscodonusage，RSCU)使用度最高的為AUG(2.9901)，最低的是CUG/GUG(0.0048)。32個密碼子RSCU值大于1.00，其中，29個密碼子堿基構(gòu)成以A或U結(jié)尾，其余4個以G或C結(jié)尾。

　　3.4葉綠體基因組重復(fù)序列分析

　　28個散在重復(fù)序列在密花香薷葉綠體基因組中被檢測到。串聯(lián)重復(fù)序列共檢測到191個，單核苷酸重復(fù)序列最多，共114個，主要以A(51)和T(56)堿基重復(fù)為主，單核苷酸T重復(fù)序列最長，為14bp，單核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列長度占總序列長度的0.6855%，3堿基串聯(lián)重復(fù)序列總數(shù)為55個，2堿基重復(fù)序列和4堿基重復(fù)序列最少為5個，復(fù)合型重復(fù)序列12個，串聯(lián)重復(fù)序列長度介于8～26bp，串聯(lián)序列總長度為1885bp，占葉綠體基因組序列總長度的1.2643%。

　　基因編碼區(qū)包含的SSR序列位點總數(shù)達84個和分布于基因間隔區(qū)(IGS)的SSR序列位點數(shù)相同，位于內(nèi)含子區(qū)域(Intron)的為21個，其余2個分布于間隔區(qū)和基因編碼區(qū)。密花香薷SSRs位點在葉綠體基因組中分布不均勻，多態(tài)性較高，為后續(xù)SSR分子標記的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

　　3.5基于葉綠體基因組的密花香薷系統(tǒng)發(fā)育分析

　　總共選取了唇形科10個屬，共18種植物葉綠體全基因組序列(括號內(nèi)為物種數(shù)目)，紫蘇屬(3)、香薷屬(1)、羅勒屬(2)、鼠尾草屬(2)、夏枯草屬(1)、青蘭屬(1)、薄荷屬(2)、黃芩屬(2)、刺蕊草屬(1)、水蘇屬(3)，外類群1個，加上本研究所測密花香薷葉綠體基因組共20個種，構(gòu)建了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，“密花香薷”與其他唇形科植物聚在一起形成一個大的分支。

　　19種唇形科植物形成2個大亞支，且分支支持率高(BP=100)，第I大亞支(BP=100)由2個分支構(gòu)成，其中一個分支包含2個亞支，一個亞支由2個分支構(gòu)成，紫蘇屬3個物種形成一個單獨分支聯(lián)合海州香薷和密花香薷形成1個分支，另一 分支由羅勒屬2個物種單獨構(gòu)成;另一亞支由鼠尾草屬2個物種單獨形成的一個分支和夏枯草屬、青蘭屬和薄荷屬6個物種形成的另一分支構(gòu)成。第II大亞支(BP=100)由黃芩屬2個物種單獨形成的一個分支和刺蕊草屬1個物種、水蘇屬3個物種聯(lián)合形成的另一姐妹分支構(gòu)成。除密花香薷和海洲香薷Elsholtziasplendens外，同屬物種均匯聚在一起形成姐妹分支。

　　4討論

　　被子植物質(zhì)體DNA通常為母系遺傳，因其在進化過程中不經(jīng)歷基因重組，通過對其序列結(jié)構(gòu)組成，特征及變異分析，可以很好地揭示物種系統(tǒng)發(fā)育過程[27]。尤其二代高通量測序技術(shù)的不斷優(yōu)化，極大地提高了測序效率，降低了測序費用，使植物葉綠體基因組測序在許多物種遺傳研究中被頻繁使用。

　　有報道研究表明，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)為雙鏈環(huán)狀DNA分子結(jié)構(gòu)，由4部分構(gòu)成，包含LSC、SSC和2個IR，其中2個IR區(qū)序列相同，方向相反[8]。測序獲得的基因組長度介于1.20×105～1.80×105bp，檢測到的編碼基因數(shù)為100～130，蛋白編碼基因數(shù)最多為70～80，30～32種不同類型的tRNA編碼基因被檢測到，rRNA編碼基因數(shù)比較穩(wěn)定，通常有4種[28]。

　　本研究所獲得密花香薷葉綠體基因組大小和結(jié)構(gòu)與上述被子植物研究結(jié)果相符。香薷屬植物約有40余種，我國分布有33種，但是有關(guān)本屬葉綠體基因組測序的報道較少，目前只有2個物種被報道，一個是海州香薷，另一個是本研究所測得密花香薷，比較兩個物種葉綠體基因組組成和特征發(fā)現(xiàn)，各個區(qū)段組成及GC含量差異不大。密花香薷基因組GC含量為37.92%，海州香薷為37.8%[29]，葉綠體基因組的總體進化速度較慢，在同屬內(nèi)植物表現(xiàn)出保守性。對測得的葉綠體基因組進行了基因功能注釋，共注釋到130個基因，檢測到了84個蛋白編碼基因，其中有4種rRNA基因被檢測到。密花香薷tRNAs基因數(shù)(37)與海州香薷(38)僅相差1個。

　　前人研究表明，不同植物所檢測到的tRNAs基因數(shù)變異較大，同一科內(nèi)其tRNA基因數(shù)目存在較大差異，如殼斗科(Fagacea)植物葉綠體基因tRNA基因數(shù)目介于29～46[4]，五加科(Araliaceae)植物葉綠體基因組tRNA基因數(shù)目介于29～38[30]，但rRNA基因數(shù)目比較保守，如裸子植物臭柏JuniperussabinaAnt.[5]、惠水金橘CitruserythrosaHort.exTan.[31]、鹽樺BetulahalophilaChingexP.C.Li[32]、殼斗科(Fagacea)植物[4]等rRNA基因數(shù)目和類型相同，均為為4種(rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23)，分布在IRs區(qū)，先前報道的海州香薷和本研究檢測到的密花香薷rRNA基因數(shù)目和類型與上述研究相同。葉綠體基因組差異主要是由反向重復(fù)區(qū)的變異引起的，而IR在穩(wěn)定葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和影響葉綠體基因組大小方面起著非常重要的作用[5]。

　　位于IRs的ycf1、ycf15、ycf68基因編碼區(qū)內(nèi)有終止密碼子，所以被稱為假基因[33]，這幾個假基因在不同種之間表現(xiàn)出廣泛的變異性，密花香薷和海州香薷主要差異也分布在IRs區(qū)，本研究密花香薷未檢測到y(tǒng)cf15、ycf682個基因，但在海州香薷中被檢測到。密花香薷基因分布和很多被子植物研究結(jié)果一致，編碼基因主要分布在LSC區(qū)，大多數(shù)的基因只含有一個外顯子，單拷貝基因居多，17個基因在IRs區(qū)重復(fù)。

　　編碼蛋白和其他被子植物一樣，根據(jù)其功能主要分為3類，(1)光合作用相關(guān)基因;(2)自身翻譯相關(guān)基因;(3)其他基因;(4)未知功能相關(guān)基因[34]。唇形科(Lamiaceae)全球分布有245屬7500余種，被認為是被子植物的第6大科，其中包含許多常見的芳香族植物和藥用植物，具有巨大的經(jīng)濟價值。葉綠體基因組因具有較強的穩(wěn)定性和保守性，所以常被用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

　　Li等[35]基于葉綠體基因組對Harley等2004年提出的唇形科的分類進行了糾正，但是唇形科內(nèi)部的許多種屬系統(tǒng)進化關(guān)系還需進一步得到解決。目前有關(guān)唇形科植物葉綠體全基因組測序報道較少，相關(guān)科及亞科內(nèi)部系統(tǒng)進化關(guān)系構(gòu)建主要利用葉綠體基因組內(nèi)部的個別功能基因如Matk、rbcl、ndhF。

　　本研究以已測得的密花香薷葉綠體基因組聯(lián)合NCBI下載的18種唇形科植物葉綠體基因組序列構(gòu)建了NJ進化樹，結(jié)果表明，該進化樹的分辨率較高，各節(jié)點也獲得了較高的支持率，唇形科內(nèi)屬間呈現(xiàn)出較為明確的發(fā)育關(guān)系，同一屬內(nèi)物種呈明顯的姐妹關(guān)系。

　　本研究所下載的18個物種序列中，除羅勒屬2個物種為羅勒亞科(Ocimoideae)外，其余均為野芝麻亞科(Lamioideae)，進化樹上并沒有將2個亞科明顯區(qū)分，羅勒屬2個物種和紫蘇屬及香薷屬聚合形成一個分支，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，但分支支持率較低(BP=75)。

　　沈立群[36]對唇形科藥用植物葉綠體基因組進行系統(tǒng)進化分析時發(fā)現(xiàn)，羅勒OcimumbasilicumL.和PerillasetoyensisL.(紫蘇屬植物)兩者之間呈姐妹關(guān)系，ML分析及MP分析給出的支持率均不高(LB=75，PB=75)，這一結(jié)論與本研究相同。香薷屬和紫蘇屬2個物種表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，這一結(jié)果和已報道海州香薷葉綠體基因組系統(tǒng)進化關(guān)系分析一致。海州香薷和密花香薷雖為同一屬物種，但并未形成姐妹分支，可能是2個種形態(tài)和分布差異較大的原因。

　　本研究首次對密花香薷葉綠體基因組進行測序組裝，并對其基因結(jié)構(gòu)、密碼子偏好性、SSRs數(shù)量及分布和基因功能等進行了分析，結(jié)合已公布的唇形科物種葉綠體基因組序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，闡明了密花香薷和唇形科內(nèi)不同屬物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不僅豐富了唇形科植物的遺傳資源，也為從分子水平進行植物分類和深入了解植物進化和系統(tǒng)發(fā)育提供了有效的途徑，這對于密花香薷植物的分類和開發(fā)研究提供了理論依據(jù)。

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　　作者：富貴1,2,3，劉晶1，李軍喬1,2,3*