摘要為了培育優質茅蒼術種質資源，提高茅蒼術藥材品質，本研究以茅蒼術植株為材料，通過接種枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、膠質芽孢桿菌Bacillusmucilaginosus以及細黃鏈霉菌Streptomycesmicroflavus的方法，考察不同菌株對其生長特性、主要藥效成分積累及其關鍵酶基因表達的影響。結果發現接種種菌株均在不同程度促進了茅蒼術的生長，過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性和葉綠素含量，以接種膠質芽孢桿菌組對蒼術苗的作用最明顯，這組的株高、莖粗、根長、根鮮質量及根干質量較對照組分別增長了23.0%、28.9%、24.2%、34.8%和39.0%，抗氧化酶活性和葉綠素含量與對照組的差異也達到顯著水平;接種膠質芽孢桿菌組羥基甲基戊二酸單酰輔酶還原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPPS)和乙酰輔酶羧化酶(ACC)基因的相對表達量均顯著增加，而另兩組只有HMGR和ACC相對表達量明顯增加。這表明不同的菌株對茅蒼術的促生作用不一，我們的研究結果為人工調控茅蒼術的栽培生產實踐提供科學依據。

　　關鍵詞茅蒼術;細菌接種;抗氧化酶;藥效成分;關鍵酶基因

　　茅蒼術Atractylodeslancea(Thunb.)DC.)為菊科Asteraceae蒼術屬AtractylodesDC.)多年生草本植物，其干燥根莖入藥即為“蒼術”蔣玲等,2017)。茅蒼術中主要包含蒼術酮、β桉葉醇等倍半萜類成分，還有蒼術素等聚乙炔類成分徐曉蘭等,2007)。茅蒼術作為江蘇省著名道地藥材，近年來由于對其野生資源的掠奪和生態環境的破壞，還有其自身原因，茅蒼術野生資源已瀕臨滅絕歐陽麗敏等,2020)。

　　雖然目前通過人工栽培在一定程度上可以解決茅蒼術資源短缺的問題，但仍然存在活性成分含量低于原產區的問題陳飄雪等,2020)，如何提高栽培地區茅蒼術品質是目前重要的研究方向之一。植物主要通過甲羥戊酸(mevalonatepathway,MVA)途徑合成倍半萜類成分，而有兩個酶在此途中起重要作用(Qianetal.,2017)。其一為羥基甲基戊二酸單酰輔酶還原酶(3hydroxymethylglutaryl coenzymeA,HMGR)，HMGR主要催化MVA的生成(Bhambhanietal.,2017)。

　　其二為法呢基焦磷酸合酶(farnesylpyrophosphatesynthase,FPPS)，FPPS催化生成倍半萜類化合物的前體法呢基二磷酸(farnesyldiphosphate,FPP)。蒼術素屬于聚炔類成分，而聚炔類化合物的生物合成與脂肪酸類似陶金華等,2014)，其中乙酰輔酶羧化酶(acetylcoenzymeAcarboxylase,ACC)是脂肪酸及聚炔類化合物生物合成途徑中的關鍵酶。ACC的表達容易受到外界因子的影響，如真菌誘導子可使ACC的表達顯著增強FigueroaBalderasetal.,2017)。植物根際存在大量微生物，它們作為土壤生態系統中物質循環和能量流動的主要推動者，可以很大程度促進藥用植物的生長，提升藥用植物的品質。

　　近年來，關于藥用植物微生物互作的研究越來越多，也有越來越多的學者開始嘗試用微生物促進開發植物資源。而微生物可以直接或間接作用于植物，對于調控藥用植物生長、影響其適應環境的能力、提高其有效成分的含量等方面都有重要的作用彭政等,2020)。已有學者在這方面對茅蒼術進行了研究，梁雪飛等(2018)在溫室條件下研究三種叢枝菌根真菌對茅蒼術的生長發育與藥效成分積累的影響，篩選出G.mosseaeBGCAM0045可作為茅蒼術苗菌根化處理的優良菌株。陳飄雪等(2020)將內生菌復合接種于茅蒼術，探究其對于茅蒼術生長和倍半萜積累的影響。

　　但尚未有學者從土壤細菌的角度研究其對茅蒼術的促生作用。本研究選擇土壤中的有益菌株：枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、膠質芽孢桿菌Bacillusmucilaginosus以及細黃鏈霉菌Streptomycesmicroflavus作為供試菌株進行研究。枯草芽孢桿菌是植物根際促生細菌(PGPR)的主要菌類之一，其會產生各類代謝物質，促進植物生長發育，增強植株抗性繼而抵抗病蟲害李怡潔和楊佐忠,2019)。研究發現枯草芽孢桿菌能提高黨參的發芽、根長、分枝等生長指標(Wuetal.,2016)。

　　膠質芽孢桿菌是一類能分解土壤和硅酸鹽礦物的化能異養型好氧菌，土壤中難以利用的鉀、磷元素都可以被此菌變為有效鉀、磷，以促進植物的生長發育田稼等,2017)。細黃鏈霉菌為鏈霉菌屬，不僅能增強植物抗病性，還能促進植物生長發育，提高作物產量李堆淑和冀玉良,2018)。本研究選取三種有益菌株接種于茅蒼術種苗，旨在模擬茅蒼術的原生境，探索其對茅蒼術的生長特性、主要藥效成分的變化以及HMGR，FPPS，ACC等關鍵酶基因的表達，考察不同菌株對茅蒼術的促生作用以及對藥效成分積累的影響，為人工調控茅蒼術的栽培生產實踐提供科學依據。

　　1結果與分析

　　1.1不同菌株對茅蒼術種苗生長的影響

　　與對照組相比，Bacillussubtilis處理組(A1)、Bacillusmucilaginosus處理組(A2)的株高、莖粗、根長均有顯著提高(P<0.05)。而Streptomycesmicroflavusvar.Lactosus處理組(A3)的各項生長指標則沒有顯著性的提高。A2處理組的株高、莖粗、根長、根鮮質量及根干質量較對照組分別增長了23.0%、28.9、24.2%、34.8%和39.0%，其根冠比也有顯著性提高。茅蒼術種苗的生長在接種種菌株后均得到了促進，其中，A2處理組效果最佳，其次為A1和A3處理組表。

　　1.2不同菌株對茅蒼術種苗抗氧化酶活性的影響

　　實驗處理0d時，各處理組之間抗氧化酶系活性幾乎沒有差異。在接種三種菌株后，茅蒼術的SOD、CAT、POD酶活性均有提高 。而A1、A2處理組對三個酶活性均影響較為顯著，其中SOD酶活性峰值分別為同期對照組水平的118%和137%，SOD酶活性分別在14d(A1)、14d(A2)和21A3)達到峰值;CAT酶活性的峰值分別為同期對照組水平的154%和148%，CAT酶活性分別在7d(A1)、14d(A2)和14d(A3)達到峰值;POD酶活性峰值則分別為同期對照組水平的106.8%和108.5%，POD酶活性均在14d達到峰值。與此同時，A3處理組的影響并不顯著。結果表明，接種種細菌均能影響茅蒼術幼苗的抗氧化酶系的活性，其中A2處理組的影響最為明顯。

　　2討論

　　本實驗共測定了種供試菌株對茅蒼術生長特性的影響，其中枯草芽孢桿菌以及膠凍樣類芽孢桿菌為根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR)，它們是天然存在于土壤并定殖于植物根際的微生物，不僅能改善土壤理化性質，還可以促進植物生長、增強植物抗逆性等郭鳳仙等,2017)。

　　這兩個處理組的茅蒼術的生長發育均得到了促進，可能是因為PGPR通過包括固氮、溶磷、解鉀、溶鐵、分泌植物激素及相關調控物質和釋放揮發性物質等機理促生孫韻雅等,2020)。而第三種細黃鏈霉菌是鏈霉菌屬放線菌，它也促進了茅蒼術的生長發育，可能是其通過作為菌肥，轉化土壤中氮磷元素提高土壤肥力，刺激茅蒼術生長譚之磊等,2008)。正常生長條件下，植物體內抗氧化酶系保持一定的活性，共同協作下清除多余的ROS(王玉卓等,2020)。

　　SOD、CAT、POD作為抗氧化酶系中的主要酶類，在正常及逆境情況下，活性會升高，及時清除植物體內活性氧，提高植物的抗逆性班甜甜等,2018)。而之前也有文獻報道，接種叢枝菌根真菌會對茅蒼術的生理活性產生顯著的影響梁雪飛等,2018)。本實驗在接種三種菌株后，發現茅蒼術的SOD、CAT、POD酶活性均有提高，其中A2處理組的影響最為明顯，其SOD、CAT、POD酶活性分別為同期對照組水平的137%、154%和108.5%，表明接種供試菌株可以調節抗氧化酶活性，在一定程度上提高茅蒼術的生理代謝能力和應對脅迫能力。

　　葉綠素含量是判斷植物光合作用強弱的指針，植物葉片衰老時葉綠素占比呈下降趨勢，而IAA、CTK則可以抑制與延緩植株葉片的衰老，使葉綠素始終占比較高。接種促生菌可以提高宿主植株吲哚乙酸及赤霉素質量分數進而提高葉綠素含量丁新景等,2016)。本研究的結果表明，三種供試菌株均提高了茅蒼術的葉綠素總量，其中A1、A2處理組提高較顯著，可能是通過提高茅蒼術吲哚乙酸及赤霉素質量分數進而增加葉綠素含量，提高植物光合效率，促進植物生長。HMGR被認為是MVA途徑上的第一個限速酶，其表達量的多少決定著許多有效藥用活性成分產量的多少(Vranováetal.,2013)。

　　本實驗中，盡管各處理組接種不同菌株后，對兩個關鍵酶基因相對表達量影響各不相同，但各組HMGR關鍵酶基因相對表達量都上調，其β桉葉醇和蒼術酮含量也上升了。而FPPS作為MVA途徑中另一個重要酶，其表達量的多少也顯著影響了倍半萜類成分的生物合成(Guoetal.,2014)。

　　各處理組的β桉葉醇和蒼術酮含量變化趨勢與FPPS表達量變化趨勢基本一致，A1與A3處理組FPPS相對表達量基本持平，沒有顯著性差異，A2處理組FPPS相對表達量顯著增加，A2處理組的β桉葉醇和蒼術酮含量顯著高于另外兩組，說明關鍵酶基因HMGR、FPPS表達量與β桉葉醇和蒼術酮的含量緊密相關陸奇杰等,2019)。ACC作為聚炔類成分生物合成路徑上的關鍵酶，其相對表達量的變化趨勢與蒼術素基本一致，說明ACC表達量與蒼術素的含量緊密相關。

　　蒼術素、蒼術酮和β⁃桉葉醇是茅蒼術的主要藥效成分，常被作為茅蒼術的質量評價指標。β⁃桉葉醇為蒼術倍半萜類代表成分，具有調節胃腸運動、抗胃潰瘍、降血糖、保護肝臟和抗菌等作用吳佳新,2016,江蘇農業科學,44(3):2830)。而接種三種供試菌株提高了茅蒼術中種主要藥效成分的含量，尤其是A2處理組，不僅對β⁃桉葉醇的積累有明顯促進作用，其對三種成分均具有明顯的促進積累的作用，極大地提高了茅蒼術的品質。

　　本研究選擇了三組供試菌株將其接種于茅蒼術幼苗，通過分析茅蒼術幼苗的生長特性、主要藥效成分積累和關鍵酶基因表達的影響來分析這三種菌株的效果。結果表明，不同的菌株對茅蒼術的促生作用不一，A2處理組的Bacillusmucilaginosus菌株對于促進茅蒼術的生長發育，提高茅蒼術的品質具有顯著的影響。本研究期望為茅蒼術優質資源的開發和可持續性利用使用菌劑提供應用基礎，為人工調控茅蒼術的栽培生產實踐提供研究依據。

　　生態學評職知識：生態學論文審稿時間長不長

　　3材料與方法

　　3.1實驗材料

　　供試茅蒼術：本實驗于2020年月20日將收集的茅蒼術種苗來自江蘇茅山地區種植于南京中醫藥大學藥用植物園人工氣候室中，經南京中醫藥大學中藥資源與開發教研室谷巍教授鑒定為菊科植物茅蒼術Atractylodeslancea(Thunb.)DC.的根莖。

　　對藥效成分含量進行測定。對照品溶液的制備：精密稱取蒼術素、蒼術酮和β桉葉醇的對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為0.149、0.150、0.150mg/mL的混合對照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取不同組別茅蒼術根莖粉末2.00，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞稱定質量，超聲0min，放冷，加甲醇補足，搖勻濾過，取續濾液過0.45μm微孔濾膜后得供試品溶液。

　　色譜條件：色譜柱：AgilentHCC18Analytical色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，流動相：乙腈0.1%甲酸水溶液，采取梯度洗脫：0~5min，A5%;5~6.25min，A10%~14%;6.25~26.25min，A14%~30%;26.25~32.5min，A30%~52%;32.5~42.5min，A52%~60%;42.5~73.75min，60%~75%;73.75~80min，A75%~80%;80~92.5min，A80%~10%，檢測波長：蒼術素340nm;蒼術酮220nm;β桉葉醇203nm，流速0.8mL/min，柱溫30°C，乙腈、甲酸均為色譜純。

　　樣品測定：取對照品溶液適量，測定對照品蒼術素、蒼術酮、β桉葉醇的峰面積，以對照品濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得到標準曲線。取10mL供試品溶液注入高效液相色譜儀中檢測，并按照標準曲線計算得到相應成分的含量。

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　　作者：裴凌峰谷宇琛谷巍1,2*張松保馬麗杰郭彥芳陳子勻張阿琴