時間:2020年12月03日 分類:推薦論文 次數:
摘 要:本文通過探討在小鼠小膠質細胞(BV-2)中由TLR2介導下產生及釋放的炎癥因子在加入姜黃素后其釋放量的變化情況,探討姜黃素對TLR2活化引起的神經炎癥及其反應的抑制作用, 為姜黃素延緩和治療神經退行性疾病提供新的思路和理論依據。
關鍵字:姜黃素;小膠質細胞;神經炎癥;TLR2
姜黃素(Curcumin)是一種從姜科植物例如姜黃或者天南星科植物的根莖中提取得到的黃色色素,為酸性多酚類物質,是一種天然小分子化合物[1]。通常用作肉類食品著色劑和酸堿指示劑,研究證明姜黃素具有抗炎、抗氧化等藥理作用[1]。應用抗炎療效較好的天然植物中的活性成分延緩神經退行性疾病的發展已成為該領域目前的研究熱點。
BV-2是小鼠的小膠質細胞,是腦內中樞系統的免疫效應細胞,有免疫監視、組織修復等作用。在特定的病理條件下小膠質細胞的過度激活會分泌炎癥因子,促進神經炎癥的發生,引起神經損傷,導致阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等神經退行性疾病的發生[2]。
神經炎癥反應是以小膠質細胞為介導,通過小膠質細胞過度激活,促進NO、TNF-α、等相關炎癥因子產生及釋放,引起神經炎癥反應。小膠質細胞介導的起神經炎癥反應是神經退行性疾病的重要病理特征之一。
TOLL樣受體(TOLL like receptors)家族是模式識別受體家族,已報道的Toll樣受體共有10個 (TLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。TLR2作為其中一員,其在炎癥反應發生過程的作用受到廣泛關注。TLR2通過識別病原體相關的分子模式(PAMPs),激活TLR2下游信號通路[5]。
TLR2信號轉導途徑包括兩種不同的方式,一種為髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴型,通過MyD88誘導IBα活化并使其磷酸化降解,釋放IBα所攜帶的核轉錄因子(NF-κB)中的兩個亞基p50與p65,調控目的基因轉錄以及炎癥因子的激活。另一種是髓樣分化因子非依賴型(MYD88),MYD88通過激活p38蛋白(P38 MAPK),活化NF-κB,促進其亞基p50與p65進入細胞核,進而調控目的基因轉錄以及炎癥因子的激活[4]。
血紅素加氧酶1(HO-1)能夠催化血紅素降解為膽綠素、二價鐵以及一氧化碳。HO-1及其產物具有抗炎、抗氧化作用,并對細胞具有一定的保護作用[1]。相關報道發現,HO-1通過調控促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP激酶,MAPK)信號通路發揮細胞保護和抗細胞凋亡的作用以及抑制炎癥反應的發生[6]。因此HO-1作為一種誘導酶以及限速酶在生物體內發揮著重要作用。
近年研究發現,神經炎癥反應在神經退行性病變中起到至關重要的作用。BV-2細胞的過度活化導致大量炎癥因子的產生和釋放,引起神經炎癥反應。姜黃素作為從天然植物提取的植物化合物,已有研究證明姜黃素具有抗炎、抗氧化等藥理作用,但對其抗神經炎癥作用及中樞神經系統的保護作用及其機制的研究仍不充分。因此本文通過Pam3CSK4刺激誘導小膠質細胞活化模擬中樞神經系統內神經炎癥反應的模型,探究姜黃素對神經炎癥的抑制作用及其機制,為姜黃素與神經炎癥相關性退行性疾病的治療與開發提供理論依據。
BV-2細胞購于美國模式培養物集存庫(ATCC),由深圳大學醫學院保存。使用完全培養基(內含10%胎牛血清、1%雙抗),2d傳代,傳代細胞密度為5×105。
MTT法檢測BV-2細胞活性
BV-2細胞接種每孔4×105個細胞的密度于12孔板,每孔1mL。將細胞分為正常組、姜黃素+Pam3CSK4組和姜黃素組,每組設2個平行孔。細胞孵育24h后加入濃度梯度(5、10、20 M)的姜黃素,孵育1h,再加入相同劑量(0.1g/mL)的Pam3CSK4刺激。孵育24小時后每孔加入MTT(5 mg/mL)10μL,培養箱孵育4-6h,吸凈上清,每孔加入DMSO液300μL,用酶標儀在570nm處檢測吸光度,計算細胞活性。
Griess法檢測NO含量
BV-2細胞接種每孔4×105個細胞的密度于24孔板,每孔500μL,待細胞貼壁后,分為正常組、姜黃素組和加入姜黃素和Pam3CSK4(0.1 g/mL)刺激組,每組設2個平行孔,加入濃度梯度(5、10、20μM)的姜黃素后,給予Pam3CSK4刺激,24h收集細胞培養液上清100μL至96孔板,再加入1:1混合均勻的100μL Griess檢測液A、B,震蕩混勻液體,用酶標儀在540nm處檢測吸光度,計算NO含量。
ELISA檢測TNF-α、PGE2含量
根據Griess法檢測NO含量的檢測結果,將其中的培養液上清液收集完全,500rpm/min,離心5min,使用ELISA雙抗夾心法檢測。
RT-qPCR法和Western Blot法測定HO-1
同樣的細胞培養方法,進行RT-qPCR檢測:
進行總RNA的提取:
從培養皿里收集細胞,盡量棄去培養基,每孔加入300μL Buffer R-Ⅰ,移液槍吹打8-10次。
轉移上述細胞懸浮液到1.5mL離心管中,用裝有21-25號槍頭的注射器反復抽吸8-10次。
加110μL Buffer R-Ⅱ,渦旋振蕩15-30s,12000g離心5min。
取上清至1.5mL離心管中,加200μL異丙醇,混合均勻。
將制備管置于2mL離心管中,將混合液轉移至備置管中,6000g離心1min。
棄濾液,于制備管中加500μL Buffer W1A,12000g離心1min。
棄濾液,于制備管中加700μL Buffer W2,12000g離心1min,以同樣的方法再用700μL Buffer W2洗滌一次。
棄濾液,,將制備管置回到2mL離心管中,12000g離心1min。
將制備管放入干凈的1.5mL離心管中,加入70-100μL Buffer TE,室溫靜置1min,12000g離心1min,洗脫得RNA。
RNA逆轉錄成cDNA
RNA定量:
使用超純水作為本底,取2μL RNA至RNA定量黑板檢測孔中進行檢測,根據檢測的數據可得RNA的濃度。
計算逆轉錄需要加入的RNA體積:X μL=1000ng/(測得濃度)ng/μL
同樣的細胞培養方法,進行蛋白免疫印跡法檢測
細胞總蛋白的提取:
細胞培養板中加入60-100μL裂解液,將細胞收集至1.5mL離心管中。12000rpm,5min,4℃,收集上清即為總蛋白,-20℃凍存。
蛋白濃度的測定:
分別取10μL樣品和BSA蛋白標準品加入到96孔板。每孔加入100μL BCA檢測液。37℃避光孵育30min。使用分光光度計測定562 nm處的吸光值。通過標準曲線計算相應的樣品蛋白濃度。
提取的總蛋白上清中加入4×上樣緩沖液,沸水浴5min,-20℃凍存。
蛋白印跡分析:
配置濃度為10%的分離膠,加入TEMED后應充分混勻,注入玻璃板間隙,并在頂層加入適量的異丙醇,室溫放置至分離膠凝固,用超純水沖洗凝膠上部數次,配置濃縮膠,插入樣品梳,垂直放置至濃縮膠凝固。
待蛋白凝膠配置結束后,根據計算所得的樣品蛋白濃度加入樣品,開始電泳,電壓為90V。電泳完成后,裁剪蛋白凝膠。在轉移緩沖液里放入裁好的膠、浸過乙醇的PVDF膜和濾紙。依次在半干轉印儀上疊放7張浸泡過轉移緩沖液的濾紙、PVDF膜,膠和另外7張浸泡過緩沖液的濾紙,蓋上轉膜裝置盒,接通電流,1.3A,18min。
將PVDF膜移至封閉液中,室溫搖動1h。孵上一抗,4℃過夜。TBST室溫洗膜洗4次,每次5min。加入二抗,室溫孵育1h,用TBST室溫洗膜3次,每次10min。
將1:1配置的ECL顯影液A和ECL顯影液B覆蓋在蛋白面的PVDF膜上,轉移到顯影盤中,放入超靈敏多功能成像儀中進行顯影。
通過MTT法檢測,單獨加入5、10、20 μM的姜黃素以及同時加入0.1μg/mg的Pam3CSK4刺激24h后,與正常組相比,實驗組細胞活性沒有明顯變化。說明在該濃度范圍內,姜黃素對小神經膠質細胞的細胞活性沒有任何影響,因此選定該范圍內的姜黃素進行下一步實驗。
Griess法測定的實驗結果如圖3,結果顯示,與正常組相比,加入Pam3CSK4刺激的BV-2細胞中NO的釋放量增加(P<0.05),說明Pam3CSK4能夠刺激激活BV-2細胞中并產生炎癥反應。但在加入5、10、20μM的姜黃素后,BV-2細胞內的NO釋放量隨著姜黃素的濃度的增加有明顯降低(P<0.05),說明姜黃素對Pam3CSK4誘導BV-2細胞炎癥因子NO釋放具有抑制作用。
與正常組相比,在加入Pam3CSK4的刺激的BV-2細胞中,炎癥因子TNF-α和PGE₂的釋放量增加,說明Pam3CSK4可以促進炎癥因子的釋放,但是在加入了不同濃度(5、10、20μM)的姜黃素后, BV-2細胞內的的炎癥因子TNF-α和PGE₂的釋放量被明顯抑制,且隨著姜黃素濃度的增加呈現遞減趨勢(P<0.05),說明姜黃素對的Pam3CSK4誘導引起的炎癥因子TNF-α和PGE₂的釋放具有抑制作用。
小膠質細胞加入姜黃素后抑制了由TLR2激動劑Pam3CSK4引起的NF-κB信號通路的活化以及核轉位,且呈現出濃度依賴性。說明姜黃素可以通過抑制NF-κB信號通路的活化和核轉位,發揮對炎性因子的抑制作用。
有研究表明,HO-1作為抗炎抗氧化的誘導酶,具有保護細胞的作用。因此,為了驗證姜黃素對Pam3CSK4誘導引起的神經炎癥的抑制作用是否與HO-1有關,在細胞中加入不同濃度的姜黃素。結果表明,不同濃度的姜黃素(5、10、20μM)可以促進HO-1的mRNA和蛋白的表達,并呈現出濃度依賴性。
討 論
1.神經退行性疾病與小膠質細胞的激活
中樞神經系統內的炎癥反應在神經退行性疾病中起著重要的作用,在特定的病理條件下小膠質細胞的過度活化,釋放NO、TNF-α、PGE2等炎癥因子,誘導氧化應激反應,促進神經元凋亡級聯反應,引起神經退行性疾病的發生。小膠質細胞的活化和炎性因子的釋放均為神經炎癥反應的特征。因此研究藥物對小膠質細胞的過度活化的抑制作用及其機制,將成為有效防治神經退行性疾病的重要思路之一,為相關的藥物開發提供了新思路。
2.姜黃素對Pam3CSK4刺激BV2細胞產生及釋放的NO、TNF-α以及PGE2的抑制作用
在炎癥因子刺激作用下,由巨噬細胞、膠質細胞等釋放大量的 NO,NO 是造成神經細胞損傷死亡的重要炎癥因子,高濃度的 NO 通過抑制或激活相關信號通路發揮細胞毒性作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一個多向性的先導感染細胞因子,可以通過激活下游的信號路徑調節炎癥的發生[8],前列腺素E2(PGE2)是花生四烯酸經過環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)催化后的主要代謝產物[9],能夠引起的炎癥因子的發生。本研究發現姜黃素可呈劑量依賴性的明顯降低Pam3CSK4誘導的BV-2細胞的NO、 TNF-α以及PGE2釋放量,從而抑制炎癥反應,保護神經元細胞,這可能是姜黃素發揮抗炎作用,延緩神經退行性疾病的機制之一。
3.姜黃素對NF-κB的抑制作用
由Pam3CSK4刺激小膠質細胞所建立的炎癥模型發現,TLR2的活化可引起NF-B信號通路的活化,調控炎癥基因的表達,促進炎癥因子及細胞因子的產生及釋放。而姜黃素可通過抑制NF-κB的核轉位[10],進而抑制由小膠質細胞過度激活所引起的炎癥因子的釋放,抑制由TLR2活化引起的炎癥反應。
4.姜黃素對HO-1蛋白表達的促進作用
HO-1在小膠質細胞中具有神經保護和抗細胞凋亡的作用。姜黃素呈劑量依賴性誘導HO-1的mRNA和蛋白的表達,激活HO-1信號通路將小膠質細胞恢復到其靜止失活狀態。通過姜黃素上調HO-1可抑制由TLR2激動劑Pam3CSK4誘導的炎癥因子的釋放。
醫學論文投稿期刊:《免疫學雜志》由中國免疫學會和第三軍醫大學主辦,1985年創刊,現為月刊,A4開本,內文92頁,銅板紙、彩圖隨文印刷,國際標準連續出版物號:ISSN:1000—8861,國內統一刊號:CN51—1332/R。
結論
由于NO、TNF-α、PGE2等炎癥因子過度激活和釋放使得腦內中樞系統產生炎癥反應,從而對神經系統造成損傷,進而引起神經退行性疾病。有研究證明,姜黃素具有抗炎、抗氧化等藥理作用,通過本研究驗證姜黃素的抗神經炎癥作用。
用TLR2的配體Pam3CSK4刺激小膠質細胞,加入不同濃度的姜黃素,應用MTT法得到姜黃素對小膠質細胞沒有毒性作用的濃度范圍。該濃度范圍的姜黃素通過抑制NF-κB的核轉位,抑制NF-κB下游信號通路中NO、TNF-α、PGE₂等炎癥因子的產生及釋放。另外,姜黃素可通過誘導HO-1的表達抑制由TLR2激動劑Pam3CSK4誘導的炎癥因子的產生及釋放。綜上所述,本研究結果表明姜黃素可以有效抑制TLR2活化引起的神經炎癥反應。
參考文獻:
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作者:楊家琪