摘要：為探究不同產(chǎn)地中國白菊的特征揮發(fā)性成分，利用吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Purge-and-trap-gaschromatography-massspectrometry,P&T-GC-MS)對江蘇如東、湖北蔣場、湖北黃潭、河南武涉、北京延慶5個產(chǎn)地的菊花樣品的揮發(fā)性成分進行檢測，利用autoGCMSDataAnal策略及化學(xué)計量算法對其特征揮發(fā)性成分進行篩選。結(jié)果共獲得醇、烯、酯、烷烴等多種共有化合物。其中，α-蒎烯、菊油環(huán)酮等化合物在如東菊花中含量最高，2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇在延慶菊花中含量最高，桉葉油醇在武涉縣菊花中含量最高，Β-倍半水芹烯、β-石竹烯等在蔣場鎮(zhèn)菊花中含量最高。另外，基于上述特征化合物的判別模型可對菊花的產(chǎn)地進行精準判別，準確率可達98%以上。本研究篩選的特征揮發(fā)性成分可為菊花的產(chǎn)地溯源提供一定的理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：菊花;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;化學(xué)計量學(xué);揮發(fā)性成分;風味物質(zhì)

　　中國白菊為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，是我國常見的一種中藥材或茶類飲品，2009年被國家列入“藥食同源”物品名單[1]。其性微寒，味苦、甘，歸肺、肝經(jīng)。具有疏風散熱、清肝護目、清熱解毒之功效。臨床上主要用于治療風熱感冒、頭暈頭痛、目赤腫痛、眼目昏花和瘡癰腫毒等[2,3]。現(xiàn)代研究表明，菊花中含有多種活性成分，如揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類、酚類和氨基酸類等[4,5]，具有抗菌消炎、降血糖、降血脂和增強免疫等作用[6-8]。

　　中醫(yī)論文投稿刊物：《中草藥》適合哪些人發(fā)表論文 是由中國藥學(xué)會和天津藥物研究院共同主辦的國家級藥學(xué)科技學(xué)術(shù)性期刊，月刊，國內(nèi)外公開發(fā)行。

　　其按品種可分為杭白菊、貢菊、滁菊、懷菊、亳菊、祁菊等，主要分布于江蘇、浙江、安徽、河南、湖北等地[9,10]。由于菊花獨特的風味以及含有豐富的活性物質(zhì)，其也已被廣泛開發(fā)成各類商品，如與不同種類的茶進行拼配的菊花茶[11,12]。揮發(fā)性化合物是菊花主要的活性成分之一，具有顯著的抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤和保護心血管等作用[13-15]，同時也是構(gòu)成菊花香氣的重要成分。國內(nèi)對菊花的研究主要集中在引種馴化、營養(yǎng)繁殖和高產(chǎn)栽培方面。并且主要關(guān)注花型、花色、抗性及產(chǎn)量方面，而忽略了菊花的香氣選育，由于對香氣的認識和了解不足，導(dǎo)致關(guān)于菊花香氣研究進度相對比較緩慢。

　　目前，國內(nèi)外菊花揮發(fā)性化合物方面的研究主要采用氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16-19]。陳志星等[20]利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid-phasemicroextractions-gaschromatgraphymassspectrometrometry,SPME-GC-MS)從菊花中共鑒定出51種揮發(fā)性成分，包括烯類、酯類、醇類，還有少量酸、雜環(huán)類和烷類物質(zhì)，其中主要成分為單萜類化合物α蒎烯(74.04%)、β-月桂烯(5.24%)、α-松油烯(3.96%)、β-蒎烯(3.44%)和γ-松油烯(2.01%)。肖作兵等[21,22]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，菊花精油中特征香氣物質(zhì)主要包括α-蒎烯、檜烯、2-β-蒎烯、β-月桂烯、對傘花烴、羅勒烯、α-萜品油烯、樟腦、異龍腦、松油醇、香芹酮、石竹烯、金合歡烯、大根香葉烯B、桉葉油醇和龍腦。

　　郭宣宣等[23]研究了不同產(chǎn)地杭白菊揮發(fā)油成分的差異并表明，杭白菊栽培品種、栽培環(huán)境和加工方法的不同，都會使其揮發(fā)油成分出現(xiàn)差異。周明瑞等[24]研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地野菊花的揮發(fā)性成分各不相同，相對含量也不一樣。欒川與嵩縣同在河南，地理位置毗鄰，其所產(chǎn)野菊花有較多的相同成分，但相對含量有很大差異;而不同省份所產(chǎn)野菊花的化學(xué)成分種類則懸殊較大，可見產(chǎn)地對成分的影響之大。黃亞非等[25]研究發(fā)現(xiàn)廣西、廣東、湖北野菊花揮發(fā)油化學(xué)成分種類和含量均有明顯的差別，并認為這些差異可能與野菊花的產(chǎn)地、氣候、生長環(huán)境采集時間以及提取條件有密切的關(guān)系。

　　綜上所述，菊花的產(chǎn)地不同會導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)組成及含量差異。 本研究以江蘇省如東縣、湖北省黃潭鎮(zhèn)、北京市延慶區(qū)、河南省武涉縣、湖北省蔣場鎮(zhèn)五個產(chǎn)區(qū)菊花作為研究對象，首次運用吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對不同產(chǎn)地菊花揮發(fā)性成分進行分析，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法高通量篩選不同產(chǎn)地菊花中的特征揮發(fā)性成分，來探究揮發(fā)性成分與產(chǎn)地之間的相關(guān)性。本文運用具有色譜圖提取，峰值提取，峰值注釋，時間偏移校正和統(tǒng)計分析等功能的軟件對數(shù)據(jù)進行分析，避免了由于人為分析工作量大且容易遺漏大部分有用化合物信息等問題，為菊花中的特征揮發(fā)性化合物的組成以及產(chǎn)地溯源分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

　　1實驗部分

　　1.1主要儀器與試劑

　　ThermoScientificTSQ9000型氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技公司);AtomxXYZ型自動進樣器(美國TeledyneTekmar公司);101-1AB型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。正己烷(色譜純，≥98%)、2,3-二甲基吡嗪(98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);1000mg/LC10-C25正構(gòu)烷烴溶液(上海安譜實驗科技股份有限公司)。

　　菊花樣品于2020年10—11月采集自當?shù)氐姆N植戶或種植基地，在采樣過程中，遵循的采樣原則為五點取樣法，即在離田塊四邊4～10步遠的地方，隨機選擇5個點取樣;取樣范圍以每個采樣點田塊或基地大小為準，每個產(chǎn)地選擇3個種植基地，每個基地取3組平行，每組平行取10～15個樣本。

　　1.2實驗方法

　　1.2.1吹掃捕集儀器方法

　　將準備好的樣品放入樣品瓶中，加入磁力轉(zhuǎn)子并轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，將每個樣品加熱至40℃，以氮氣(純度99.99%)為吹掃氣體，吹掃11min。吹掃流速為100mL/min，捕集阱溫度為280℃，解吸溫度為250℃，解吸時間為2.00min，傳輸線溫度為140℃。

　　1.2.2氣相色譜-質(zhì)譜分析色譜柱為熔融石英毛細管柱DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm);載氣為高純氮氣(純度99.99%)，進樣口溫度為200℃;程序升溫過程如下：初始溫度為40℃，保持3min，以3℃/min升溫至100℃，保持1min，再以8℃/min升溫至240℃，保持5min。離子化方式為電子轟擊離子化(EI源);傳輸線溫度為240℃;離子源溫度為280℃;溶劑延遲時間為2min;氦氣流速為1.000mL/min;分流比為30mL/min;使用全掃描模式進行定性分析;質(zhì)譜檢測范圍為30～450m/z。

　　1.2.3標準溶液配置方法取100μL正構(gòu)烷烴，用正己烷稀釋100倍，然后用注射針進行液體進樣，用于化合物保留指數(shù)計算;取10μL2,3-二甲基吡嗪，用超純水稀釋2000倍，得到最終濃度為0.051mg/L的內(nèi)標溶液，用于菊花揮發(fā)性成分的定量分析。

　　1.2.4菊花樣品的處理方法采樣獲得的菊花鮮樣于60℃烘箱中干燥24～48h，干燥后的樣本于室溫下干燥儲存。取1.00g菊花干樣于進樣瓶中，加入1.00mL內(nèi)標溶液，用于吹掃捕集-GC-MS分析。

　　1.3數(shù)據(jù)處理菊花樣品的GC-MS數(shù)據(jù)通過實驗室自主開發(fā)的autoGCMSDataAnal軟件[26]進行解卷積和主要差異性化合物初步篩選。化合物鑒定基于質(zhì)譜匹配NIST庫(2017版)和保留指數(shù)(NISTChemistryWebBookSRD69(https://webbook.nist.gov))。SIMCA(Version14.1)軟件用于不同產(chǎn)地菊花特征揮發(fā)性化合物的精準篩選。IBMSPSSStatistics19軟件用于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ArtificialNeuralNetwork，ANN)分析;MATLAB2017a用于偏最小二乘判別分析(PartialLeastSquaresDiscriminantAnalysis，PLSDA);SYSTAT13軟件用于線性判別分析(lineardiscriminantanalysis，LDA)。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1不同產(chǎn)地菊花揮發(fā)性成分的GC-MS分析

　　為了明確不同產(chǎn)地菊花中的主要揮發(fā)性成分，5種來自不同產(chǎn)地的藥用菊花被采集并按同一方法進行干燥加工，后通過吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜對其揮發(fā)性成分進行檢測。結(jié)果顯示，從5個產(chǎn)地的菊花中檢測到多種共有揮發(fā)性化學(xué)成分，主要包括醇類、烯類、烷類、酯類以及少量雜環(huán)類化合物，其中α-蒎烯、桉葉油醇、菊油環(huán)酮、β-石竹烯、1-戊烯-3-醇等為主要化合物。實驗結(jié)果表明5種產(chǎn)地菊花中含量較高的化合物主要為烯類以及醇類物質(zhì)，該結(jié)果與夏延斌等[27]的研究相符。

　　2.25種產(chǎn)地菊花的特征揮發(fā)性成分的精準篩選

　　為了進一步研究如東、蔣場、黃潭、武涉以及延慶菊花中特征揮發(fā)性化合物，采用autoGCMSDataAnal策略及化學(xué)計量算法對其特征揮發(fā)性成分進行初步篩選并用PLSDA進行判別分析，不同產(chǎn)地的菊花樣本得到較好的聚類，黃潭與武涉以及延慶菊花樣本部分重疊，如東與蔣場菊花得到較好的區(qū)分。各個化合物的變量投影重要性分析值(VIP)，通常認為，VIP值大于1的變量為差異性化合物，可知5個產(chǎn)地菊花樣本的VIP>1的化合物共有23個，其中Var6和Var18的化合物的含量僅為其他成分的千分之一，VIP值也較低(分別為1.05和1.19)，且無法進行準確定性，作為特征性揮發(fā)成分意義不大，因此本文著重討論其他21個化合物，分別為α-蒎烯、2-甲基-5-(1-甲基乙基)-雙環(huán)[3.1.0]-2-己烯、1-戊烯-3-醇、4-異丙基甲苯等。

　　由結(jié)果可知，5個產(chǎn)地的菊花樣本特征揮發(fā)性化合物主要集中在烯類和醇類中。其中如東縣菊花樣本中菊油環(huán)酮、α-蒎烯、龍腦、4,7,7-三甲基雙環(huán)[3.2.0]庚-3-烯-6-酮、1,2,4-三甲基苯、2-環(huán)己烯-1-醇和(1R,5R)-rel-香芹醇含量顯著高于其他產(chǎn)地菊花樣本;黃潭鎮(zhèn)菊花樣本中α蒎烯和2-甲基-5-(1-甲基乙基)-雙環(huán)[3.1.0]-2-己烯化合物的含量最高，尤其是2-甲基-5-(1-甲基乙基)-雙環(huán)[3.1.0]-2-己烯，含量是其他產(chǎn)地2至40倍;延慶地區(qū)的菊花樣本中α-蒎烯、樟腦、β-石竹烯和2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇含量較高，其中β-石竹烯和2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇含量遠高于其他產(chǎn)地菊花;武涉縣菊花中桉葉油醇、樟腦、4-異丙基甲苯、反式-4-(異丙基)-1-甲基環(huán)己-2-烯-1-醇、1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇乙酸酯含量較高，其中桉葉油醇、反式-4-(異丙基)-1-甲基環(huán)己-2-烯-1-醇和1-辛烯-3-醇乙酸酯化合物含量顯著高于其他菊花樣本;蔣場鎮(zhèn)福田白菊樣本中α-姜黃烯、姜烯、Δ-杜松烯、Β-倍半水芹烯、菖蒲二烯和(Z,E)-α-金合歡烯含量較高，顯著區(qū)別于其他產(chǎn)地的菊花樣本。

　　2.35種產(chǎn)地菊花的化學(xué)計量學(xué)分析

　　將所得到差異性化合物用于菊花產(chǎn)地判別的可行性研究，通過線性判別分析(LDA)，偏最小二乘判別分析(PLSDA)以及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等算法等對不同產(chǎn)地菊花進行產(chǎn)地溯源研究。結(jié)果表明，3種化學(xué)計量學(xué)模型均能得到良好的判別效果，線性判別分析中刀切交叉驗證準確率達99%，PLSDA和ANN分析結(jié)果訓(xùn)練集和預(yù)測集的準確率均能達到98%以上，實現(xiàn)了不同產(chǎn)地菊花快速準確的產(chǎn)地溯源。上述結(jié)果表明產(chǎn)區(qū)環(huán)境對菊花揮發(fā)性化合物的積累具有顯著的影響，使得不同產(chǎn)地菊花形成各自獨特的香味。

　　3結(jié)論

　　本文以5種不同產(chǎn)地中國白菊為研究對象，利用吹掃捕集-氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了菊花中含有的揮發(fā)性化合物，結(jié)果表明5種產(chǎn)地菊花中均含有醇類、烯類、酯類以及少量雜環(huán)類化合物。通過autoGCMSDataAnal策略以及化學(xué)計量學(xué)手段共篩選并定性定量分析了21種特征揮發(fā)性成分，其中烯類和醇類為主要特征成分。其中蔣場菊花中有3種區(qū)別于其他產(chǎn)地菊花的特征性化合物，武涉菊花有3種特征性化合物，延慶菊花有3種特征性化合物，黃潭菊花有1種特征性化合物，如東菊花有4種特征性化合物。

　　這些特征性揮發(fā)成分如α-蒎烯、β-石竹烯、1-戊烯-3-醇等也是食品中常見的香精，具有不同的香味，賦予了不同產(chǎn)地菊花不同的風味。通過21種差異性化合物與不同產(chǎn)地菊花之間的關(guān)聯(lián)建立智能化判別模型(包括PLSDA、ANN和LDA)，模型準確率可達到98%以上，表明基于特征揮發(fā)性化學(xué)成分可實現(xiàn)菊花的地理溯源。本研究為不同產(chǎn)地中國白菊揮發(fā)性化合物的研究提供了部分特征化合物，并為菊花產(chǎn)地溯源的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，但由于本研究所選取的菊花產(chǎn)地及品種較少，普適性一般，因此，還需進一步研究更多產(chǎn)地以及品種的菊花特征揮發(fā)性化合物。

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　　作者：海城英1，白秀云1，陳亨業(yè)1，楊小龍1，楊健2，付海燕*1