摘要:目的建立嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘檢測技術，并對市售奶粉中苯并[a]芘含量進行調查分析。方法嬰幼兒奶粉在堿性條件下用乙醚-石油醚(1∶1，V/V)提取，然后用1.5mol/L氫氧化鉀乙醇溶液皂化，固相萃取柱凈化后，經DB-EUPAH色譜柱(20m×0.18mm×0.14μm)分離后氣相色譜質譜法檢測，D12-苯并[a]芘內標定量。

　　結果當嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘加標0.3、1.0和5.0μg/kg時，平均回收率分別為116.7%、86.0%、96.4%，相對標準偏差為10.5%、4.2%和4.4%(n=6)。方法定量限為0.3μg/kg，檢出限為0.1μg/kg，采用本方法對市售的40份國產及進口嬰幼兒奶粉進行測定，苯并[a]芘含量范圍為<0.1～0.25μg/kg，檢出率為32.5%。結論本方法簡便快速準確，凈化效果好，靈敏度高，滿足嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘檢測要求。目前市售嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘含量處于較低水平。

　　關鍵詞:嬰幼兒奶粉苯并[a]芘氣相色譜質譜法

　　食品檢測多環芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是“優先級”環境和食品污染物，是分布最廣的一類致癌物。食品中的PAHs不僅源于環境的污染，還源于食品加工、儲存和烹飪過程的污染[1-2]。嬰幼兒奶粉原料乳和配料中植物油(如椰子油、棕櫚油等)易受到PAHs污染，加工過程熱處理可能產生多環芳烴[3]，因為奶粉在嬰幼兒膳食中的重要貢獻，成為國內外監管重點關注的食品。歐盟法令No.835/2011規定嬰幼兒奶粉和牛奶中苯并[a]芘不能超過1.0μg/kg[4]，推薦的檢測方法包括液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)、氣相色譜質譜法(gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)，要求方法達到的檢出限為0.1μg/kg[1]。

　　我國的GB2762—2017《食品安全國家標準食品污染物限量標準》未對嬰幼兒食品(包括奶粉)中苯并[a]芘進行限量規定，還缺乏我國嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘含量基礎數據。GB5009.27—2016《食品安全國家標準食品中苯并[a]芘的測定》[5]和GB5009.265—2016《食品安全國家標準食品中多環芳烴的測定》[6]均可以測定食品中苯并[a]芘，包括HPLC法[2-3，5，7]和GC-MS法[2，6，8-10]，但這兩個標準均未涉及嬰幼兒奶粉，且方法前處理、靈敏度不能滿足歐盟嬰幼兒奶粉苯并[a]芘1.0μg/kg限量、檢出限0.3μg/kg、回收率50%～120%要求[1]。本研究旨在建立嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘準確、快速且操作簡便的GC-MS測定方法，同時對杭州市售的嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘含量進行調查。

　　1材料與方法

　　1.1樣品和試劑

　　20.0μg/mL苯并[a]芘標準甲醇溶液購自國家標準物質中心;10.0μg/mLD12-苯并[a]芘內標溶液(購自德國Dr.Ehrenstorfer公司)，橄欖油多環芳烴標準物質(編號T0665QC，購自上海博尼生物科技有限公司)，固相萃取柱(二乙烯基苯聚合物+N-丙基乙二胺250mg/6mL，購自康源科技有限公司)。丙酮、異辛烷、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純(購自MERCK美國)，無水乙醇、無水乙醚、石油醚、濃氨水、氫氧化鉀、無水硫酸鈉均為分析純(購自國藥)，超純水(Milli-Q，美國Millipore公司)。40份國產及進口嬰幼兒奶粉購自杭州超市。

　　1.2儀器6890GC-5973MS氣相色譜質譜聯用儀(美國Agilent公司);色譜柱DB-EUPAH毛細管色譜柱(20m×0.18mm×0.14μm，美國Agilent公司);多樣品漩渦振蕩器(德國Heidolph);高速離心機(美國Beckman公司);固相萃取裝置(CNW公司)，氮吹儀(上海安譜公司)，分析天平(感量0.01g，MettlerToledo公司);超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

　　1.3標準溶液的配制

　　1.3.10.2μg/mL苯并[a]芘標準使用液吸取0.25mL20.0μg/mL苯并[a]芘標準甲醇溶液，用丙酮定容至25mL，4℃避光保存。

　　1.3.20.1μg/mLD12-苯并[a]芘內標溶液吸取0.25mL10.0μg/mLD12-苯并[a]芘內標溶液，用丙酮定容至25.0mL，4℃避光保存。

　　1.3.3標準工作液分別吸取0.2μg/mL苯并[a]芘標準使用液2.5、5、10、25和50μL，再加入50μL0.1μg/mLD12-苯并[a]芘內標溶液，用丙酮-異辛烷(1∶1，V/V)補充至100μL，濃度范圍為10～100ng/mL(含D12-苯并[a]芘50ng/mL)，混勻后進行GC-MS測定。

　　1.4樣品處理

　　1.4.1提取

　　參考GB5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[12]第三法堿水解法，稱取2.00g(精確至0.01g)奶粉于50mL離心管中，加入50μL0.1μg/mLD12-苯并[a]芘內標溶液，加10mL水，渦旋后在45℃的水浴中放置10min，溶解后加2mL氨水充分混勻，緩慢加入10mL無水乙醇徹底地進行混勻，加入8mL無水乙醚，渦旋振蕩5min，再加入8mL石油醚，渦旋振蕩5min，然后放入離心機中，8000r/min離心5min，吸出上層有機相，在40℃的水浴下氮氣吹干溶劑得到脂肪提取物。

　　1.4.2皂化[2，6]脂肪提取物中加入5mL1.5mol/L氫氧化鉀乙醇溶液，渦旋混勻，70℃水浴放置3min，取出用自來水冷卻至室溫后加入5mL正己烷、4mL水，渦旋提取2min，10000r/min離心2min，上層正己烷相提取液待凈化。

　　1.4.3凈化[2，6]在固相萃取柱上加1.0g無水硫酸鈉，用3mL二氯甲烷、3mL正己烷依次淋洗活化柱子，活化結束后吸取上述正己烷相提取液轉移到固相萃取柱上，控制流速在1.0mL/min左右，待過柱后，用4ml正己烷淋洗除雜，最后用5mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1∶1，V/V)洗脫收集于10mL錐底玻璃試管內，洗脫液在40℃下用氮氣吹干，加50μL丙酮-異辛烷(1∶1，V/V)溶解殘留物，轉移至進樣瓶中，待GC-MS分析。

　　1.4.4空白試驗

　　在不取樣品的情況下，與樣品一起進行空白試驗。

　　1.4.5質量控制

　　稱取0.5g橄欖油多環芳烴標準物質，加入50μL0.1μg/mLD12-苯并[a]芘內標溶液，然后按照1.4.2皂化、1.4.3凈化后測定。

　　1.5儀器條件[2，6]

　　1.5.1色譜條件

　　色譜柱DB-EUPAH毛細管(20m×0.18mm×0.14μm，美國Agilent公司);進樣口溫度280℃;載氣氦氣，純度≥99.999%;進樣體積2μL，不分流進樣，溶劑延遲時間為25min;柱溫程序:初溫80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，保持2min，以8℃/min升至320℃，保持5min。

　　1.5.2質譜條件

　　離子源:電子轟擊源(EI);電離能量為70eV;離子源溫度230℃;傳輸線溫度280℃;四級桿溫度150℃;監測離子:苯并[a]芘定量離子(相對豐度)為252(100)，定性離子250(20)、253(20)，D12-苯并[a]芘定量離子為264(100)，定性離子為260(20)，樣品中目標化合物的定性離子與定量離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過20%。

　　2結果

　　2.1儀器分析

　　采用DB-EUPAH色譜柱，在本實驗條件下苯并[a]芘及D12-苯并[a]芘內標質量色譜。

　　2.2質量控制

　　目前還沒有奶粉中苯并[a]芘標準物質，用低含量橄欖油多環芳烴標準物質進行內控，三次測定苯并[a]芘平均結果為1.56μg/kg，橄欖油標準物質苯并[a]芘賦值為1.61μg/kg，含量范圍為0.90～2.32μg/kg，說明本方法測定結果準確可靠。

　　2.3方法線性范圍和檢出限

　　在本儀器條件下對標準工作液進行測定，測得苯并[a]芘和內標物D12-苯并[a]芘的相應峰面積，在10～100ng/mL濃度范圍內，苯并[a]芘與內標D12-苯并[a]芘的濃度比為橫坐標x，以苯并[a]芘峰面積與內標D12-苯并[a]芘峰面積比(響應比)為縱坐標y，線性方程為y=0.276x+0.004，r2=0.997。在嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘加標0.3μg/kg測定6次，苯并[a]芘平均信噪比(S/N)為22.6。另外基于苯并[a]芘無處不在，整個空白試驗含量在未檢出～0.1μg/kg之間，因此確定本方法定量限為0.3μg/kg，檢出限為0.1μg/kg(S/N=6)，嬰幼兒奶粉及加標(0.3μg/kg)測定疊加圖。

　　2.4準確度和精密度實驗

　　對空白嬰幼兒奶粉進行苯并[a]芘加標0.3、1.0和5.0μg/kg回收試驗，方法準確度、精密度實驗結果。

　　2.5樣品測定

　　對市售的40份國產及進口嬰幼兒奶粉進行苯并[a]芘含量分析，其中12份國產、28份進口奶粉。結果苯并[a]芘檢出率32.5%，含量范圍為<0.1～0.25μg/kg，均小于歐盟嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘1.0μg/kg限量規定。

　　3討論

　　測定食品、環境中苯并[a]芘等多環芳烴的方法主要有HPLC熒光檢測器法、GC-MS等[1]。歐盟對嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘限量要求嚴格，且奶粉基質復雜，因此要求方法靈敏度、準確度高。GC-MS抗干擾能力強，采用同位素內標定量更加準確，本方法采用同位素稀釋GC-MS測定嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘能滿足要求。

　　嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘等多環芳烴的提取有直接皂化法[3，9]、溶劑提取法[8]、分散固相萃取法[7]等。嬰幼兒奶粉生產工藝復雜，配料多，且含有較高脂肪，溶劑提取法存在提取不完全等問題，本次采集的40份嬰幼兒奶粉脂肪含量在22.3%～29.5%，平均含量為25.6%，基本與標簽標識的脂肪含量相一致。

　　由于苯并[a]芘等多環芳烴屬于脂溶性化合物，多與脂肪類化合物共存，DOBRINAS等[8]和婁婷婷等[10]采用溶劑提取后不凈化直接進樣GC-MS分析，雜質干擾大，且對儀器、色譜柱損傷大，靈敏度下降快。本方法參考GB5009.6—2016食品中脂肪的測定，先用堿水解提取奶粉中脂肪，然后進行皂化除去脂肪，固相萃取進一步凈化除去干擾，使得方法簡便，且具有較高的靈敏度、準確度。苯并[a]芘等多環芳烴是環境污染物，無處不在，空白值對低含量的嬰幼兒奶粉測定影響非常大，在實驗過程必須嚴格加以控制。試劑、器皿、濃縮裝置等是空白值的主要來源。

　　為了降低實驗過程苯并[a]芘空白值，玻璃容器可以通過400℃高溫烘烤或者正己烷淋洗除去，濃縮裝置用丙酮等充分清洗干凈。同時減少試劑用量，減少實驗轉移步驟來控制污染[2]。本實驗條件下空白實驗苯并[a]芘含量小于方法檢出限0.1μg/kg，有效保證結果的準確性。

　　綜上所述，本方法采用堿水解、皂化后固相萃取凈化，同位素內標稀釋法結合GC-MS法測定嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘，方法操作簡便，凈化效果好，定性定量準確，方法定量限為0.3μg/kg，檢出限為0.1μg/kg，完全滿足歐盟對嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘1.0μg/kg限量規定。監測顯示市售嬰幼兒奶粉中苯并[a]芘處于較低水平。

　　參考文獻

　　[1]EuropeanFoodSafetyAuthority.PolycyclicAromaticHydrocarbonsinFoodScientificOpinionofthePanelonContaminantsintheFoodChain.[EB/OL].[2019-05-30].

　　[2]吳永寧.食品中有機污染物檢測方法標準操作程序[M].北京:中國質檢出版社，2018.

　　[3]CHOHK，SHINHS.EvaluationofpolycyclicaromatichydrocarboncontentsandriskassessmentforinfantformulainKorea[J].FoodSciBiotechnol，2012，21(5):1329-1334.

　　[4]CommissionRegulation(EU).No835/2011of19August2011.amendingRegulation(EC)No1881/2006asregardsmaximumlevelsforpolycyclicaromatichydrocarbonsinfoodstuffs[S].Brussels:CommissionRegulation(EU)，2011.

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