《刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機(jī)制》論文發(fā)表期刊：《北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》；發(fā)表周期：2021年03期

《刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機(jī)制》論文作者信息：張海燕( 1993—) ，女，碩士，醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌疾病基礎(chǔ)及臨床研究; 通信作者: 熊莉華 ( 1973—) ，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌疾病基礎(chǔ)及臨床研究．

　　摘要：目的 探討刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機(jī)制方法 尾靜脈注射鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂飲食制備2型糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為模型組、刺五加多糖低劑量組(60 mg/kg)、中劑量組(120 mg/kg)、高劑量組(240mg/kg);另設(shè)置普通飼料喂養(yǎng)的大鼠為對照組·連續(xù)給藥6周后觀察大鼠的一般狀況，腹主動脈取血，檢測空腹血糖、糖化血紅蛋白、血脂指標(biāo)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛水平，取血后迅速分離肝臟組織，進(jìn)行HE染色：采用Western blot檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4Glucose transporter 4，GLUT-4)、胰島素受體底物2(Insulin receptor substrate 2.1RS-2)、過氧化物酶體增殖物激活受體y(Peroxisome proliferator-activated receptor-y，PPAR-y)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3kinase，P13K)、磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平結(jié)果 與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺五加多糖各劑量組大鼠12h飲水量、尿量、進(jìn)食量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平明顯降低，高密度脂蛋白水平明顯升高;刺五加多糖低、中、高劑量組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘腳過氧化物酶水平明顯升高，丙二醛水平明顯降低上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組GLUT-4.IRS-2.PPAR-y、PI3K、磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高，刺五加多糖低劑量組GLUT-4、PPAR-y蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0).結(jié)論 刺五加多糖在改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝中療效確切，激活I(lǐng)RS-2/P13K/磷酸化Akt信號通路和上調(diào)GLUT-4和PPAR-y表達(dá)是其作用機(jī)制之一.

　　關(guān)鍵詞：糖尿病大鼠;刺五加多糖：代謝功能;肝臟;作用機(jī)制

　　Abstract: Obiective To investigate the effect of Acanthopanax senticosus polysaccharides on metabolic function and its mechanism in diabetic rats. Method The rat model of tvpe 2 diabetes mellitus was established by tail injection of streptozotocin combined with high-fat diet. The rats were randomly divided into model group. low-lose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (60 mg/kg) , medium-dose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (120 mg/kg) and high-dose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (240 mg/kg) . The rats fed with nommal diet were set as control group. After 6 weeks of continuous administration, the general condition of rats wasobserved. Blood samples were taken from abdominal aorta to detect the levels of fasting blood glucose , glycosylated hemoglobin, fasting insulin , blood lipid index , superoxide dismutase (SOD) , catalase , glutathione peroxidase and malondialdehyde. Westem blot was used to detect the expression of glucose transporter 4 (GLUT-4) , insulin receptor substrate 2 (IRS-2) . peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR-y) , phosph-atidylinositol 3-kinase (PI3K) and phosphorylated Akt protein. Results Compared with the model group. the body weight of rats in medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysaccharide increased significantly (P<0.05): The amount of drinking water, urine and food intake of rats in low, medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysaccharide decreased significantly (P<0.05) . Compared with the model group, the levels of fasting blood glucose, glycosylated hemoglobin, triglyceride, total cholesterol and lowdensity lipoprotein significantly decreased, while the levels of high-dlensity lipoprotein significantly increased in the medium and highdose Acanthopanax senticosus polysacchar groups (P<0.05) . The levels of SOD, catalase and glutathione peroxidase in low, medium and high dose Acanthopanax senticosus polysacchar groups significantly increased, while the level of malondialdehvde significantly decreased (P<0.05) . Compared with the model group, the protein expression levels of GLUT-4. IRS-2. PPAR-y, PI3K and phosphorylated Akt in the medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysacchar significantly increased, and the protein expression levels of GLUT4 and PPAR-y in the low dose group of Acanthopanax senticosus polysacchar significantly increased (P <0. 05 ).Conclusion Acanthopanax senticosus polysacchar has a definite effect on improving glucose and lipid metabolism in type 2 diabetic rats. One of its mechanisms is to activate IRS-2/PI3K/phosphorylated Akt signaling pathway and uptregulate the expression of GLUT-4 and PPAR-y.

　　Key words: diabetic rats: Acanthopanax senticosus polysacchar: metabolic function: liver: mechanism of action

　　2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，隨著病程的進(jìn)展，會出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變、腎損傷等一系列并發(fā)癥[1.2型糖尿病臨床主要通過注射胰島素和口服降糖藥來控制血糖，為進(jìn)一步提升血糖控制效果，近年來中藥制劑受到了廣泛關(guān)注2刺五加主要分布于我國吉林、黑龍江、遼寧、河北等省區(qū)，具有“補(bǔ)中益精”的作用[3]對于刺五加全藥降糖作用已有研究報(bào)道，但仍未明確其中具體起效的成分，這不利于刺五加相關(guān)降糖藥物的開發(fā)與應(yīng)用[1.目前，從天然藥物中發(fā)現(xiàn)的降糖成分包括生物堿、多糖、皂苷、黃酮等[].本研究通過動物學(xué)實(shí)驗(yàn)來探討刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機(jī)制，旨在為降糖中藥制劑的研發(fā)提供參考.

　　1材料與方法

　　1.1 動物與主要試劑

　　清潔級雄性Wistar大鼠(中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK(滬)20140004)100只，6周齡，體質(zhì)量130-170 g.刺五加多糖(寧波金艾農(nóng)生物科技有限公司，總收率為原刺五加質(zhì)量的0.61%，HPLC純度>90%);鏈脈佐菌素(上海撫生生物有限公司);血m糖、糖化血紅蛋白、血脂指標(biāo)檢測試劑盒(北京九強(qiáng)生物股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(武漢明德生物股份有限公司);葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose transporter 4，GLUT4)、胰島素受體底物2(Insulin receptor substrate 2，1RS-2)、過氧化物酶體增殖物激活受體y(Peroxisome proliferatoractivated receptor-y，PPAR-y)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosph-atidylinositol 3kinase，PI3K)、磷酸化Akt一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京博奧森生物有限公司).

　　1.2方法

　　1.2.1 2型糖尿病大鼠模型制備

　　100只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，室溫24℃，濕度60%，燈光模擬晝夜交替，自由飲水和進(jìn)食隨機(jī)分為對照組15只，實(shí)驗(yàn)組85只對照組僅給予普通飼料;實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料，具體配方：1.5%膽固醇，0.25%膽酸鈉，10%豬油，5%蔗糖，83.25%基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)4周后禁食12 h，按30 mg/kg劑量尾靜脈注射鏈脲佐菌素制備2型糖尿病模型，注射鏈脲佐菌素72h后尾靜脈取血，檢測血糖水平，選擇其中60只血糖超過11.1 mnol/L的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

　　1.2.2 分組與給藥

　　將60只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、刺五加多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15只對照組和模型組大鼠按10 ml./kg每日給予蒸餾水灌胃;刺五加多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組根據(jù)刺五加人體臨床用藥上限的2倍、4倍、8倍劑量折算，即刺五加多糖給藥劑量分別為60，120.240 mg/kg，制成10 ml./kg藥液灌胃，連續(xù)給藥6周.

　　1.2.3 一般狀況觀察及生化指標(biāo)檢測給藥6周結(jié)束后測定大鼠的體質(zhì)量，使用代謝籠測定大鼠12h的飲水量、尿量、進(jìn)食量禁食8h，腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，收集血清，

　　-20℃保存待測·檢測大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、血脂指標(biāo)、SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛水平.

　　1.2.4 肝臟組織病理學(xué)檢測

　　取血后迅速分離大鼠肝臟組織，放于冰上切取部分組織-80℃保存，用于Western blot檢測.其余肝組織石蠟包埋、切片后行HE染色，光學(xué)倒置顯微鏡下拍照，分析組織病理學(xué)改變.

　　1.2.5 胰島素信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Wetern blot檢測大鼠肝組織中GLVT-4、IRS-2 PPAR-y、PI3K、磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平.取標(biāo)本組織放于培養(yǎng)皿中，剪成組織碎塊放入離心管中，加入磷酸緩沖液進(jìn)行組織勻漿，冰上靜置20 min，4℃ 12000/min離心10 min，收集上清液放入新離心管中，BCA試劑盒測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，按說明書比例將稀釋后的一抗加至PVDF膜，將膜完全覆蓋，搖床上4℃過夜，次日加稀釋后的二抗，2h后顯影，ImageJ讀取條帶上的灰度值.

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　應(yīng)用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，進(jìn)行方差分析和1檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

　　2果

　　2.1 各組大鼠體質(zhì)量、飲水量、尿量及進(jìn)食量模型組大鼠體質(zhì)量明顯高于對照組大鼠，12 h飲水量、尿量、進(jìn)食量明顯高于對照組大鼠，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺五加多糖各劑量組大鼠12h飲水量、尿量、進(jìn)食量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見表1.

　　2.2 各組大鼠糖脂代謝指標(biāo)模型組大鼠各糖脂代謝指標(biāo)與對照組之間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平明顯降低，高密度脂蛋白水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見表2.

　　2.3各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)

　　模型組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平均明顯低于對照組，丙二醛水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組大鼠比較，刺五加多糖低、中、高劑量組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平明顯升高，丙二醛水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見表3.

　　2.4 刺五加多糖對大鼠肝臟病理學(xué)改變的影響

　　對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊且 形態(tài)完整.模型組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改 變，表現(xiàn)為肝細(xì)胞大泡性的脂肪樣變、肝索排列紊 亂、肝靜脈擴(kuò)張、細(xì)胞腫脹.刺五加多糖低劑量組大 鼠肝組織肝索排列欠整齊，部分肝細(xì)胞腫脹; 中劑 量組大鼠肝組織肝索排列較整齊，少量肝細(xì)胞腫脹 和淡染; 高劑量組大鼠肝組織肝索排列較整齊，很 少見腫脹肝細(xì)胞.見圖 1.

　　2.5 刺五加多糖對大鼠胰島素信號通路相關(guān)蛋白 表達(dá)的影響

　　模型組胰島素信號通路相關(guān)蛋白 GLUT-4、 IRS-2、PPAR-γ、PI3K、磷酸化 Akt 的表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05) ; 與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組 GLUT- 4、IRS-2、PPAR-γ、PI3K、磷酸化 Akt 蛋白表達(dá)水平明顯升高，刺五加多糖低劑量組 GLUT-4、PPAR-γ蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P< 0.05) .見圖 2、表 4.

　　3 討 論

　　本研究通過脲佐菌素聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示: 模型組大鼠體質(zhì)量明顯低 于對照組大鼠，且出現(xiàn)多飲水、多進(jìn)食、多尿量的典 型 2 型糖尿病癥狀，提示造模成功.刺五加多糖能夠明顯改善大鼠多飲水、多進(jìn)食、多尿量的癥狀，提 示刺五加多糖具有抗 2 型糖尿病的藥理活性.2 型糖尿病患者多伴有不同程度的糖脂代謝紊亂，高脂血癥又會進(jìn)一步加重胰島素抵抗[6].本研究結(jié)果顯示: 刺五加多糖中、高劑量能夠有效降低 2 型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平，進(jìn)一步證明了刺五加多糖對 2 型糖尿病大鼠糖脂代謝的回調(diào)作用.

　　氧化應(yīng)激是活性氧等物質(zhì)因清除率下降所致 的體內(nèi)抗氧化防御與自由基生成之間平衡失調(diào)，在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作 用[7].SOD 是清除氧自由基的主要活性酶之一[8]; 過氧化氫酶能夠較好地清除細(xì)胞產(chǎn)生的過氧化氫， 在維持細(xì)胞氧化平衡中發(fā)揮重要作用[9]; 谷胱甘 肽過氧化物酶是在人體中廣泛存在的催化氧化酶，能夠清除氧自由基[10 血清SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平變化能夠較好地反映出體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度.本研究結(jié)果顯示：刺五加多糖低、中、高劑量組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平明顯高于模型組，丙二醛水平明顯低于模型組，提示刺五加多糖能夠有效降低2型糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化能力.肝臟在維持血糖穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，是機(jī)體糖代謝的重要器官[1].本研究結(jié)果顯示：刺五加多糖能夠有效改善2型糖尿病大鼠肝臟病理學(xué)改變，減輕肝細(xì)胞腫脹及中心粒細(xì)胞浸潤程度，有利于糖脂代謝指標(biāo)的改善.肝臟糖代謝異常能夠引發(fā)胰島素抵抗，胰島素在肝臟中主要通過1RS-21

　　P13K/磷酸化Akt信號通路發(fā)揮作用[12.同時(shí)，GLUT4功能異常是脂肪組織發(fā)生胰島素抵抗的主要原因[1;PPAR-y是配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，參與胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展[1];脂肪組織是PPAR-y激活劑的主要靶點(diǎn)[5]本研究結(jié)果顯示：刺五加多糖中、高劑量能夠激活I(lǐng)RS-2/P13K/磷酸化Akt信號通路，同時(shí)上調(diào)GLUT4和PPAR-y表達(dá);而刺五加多糖低劑量僅能夠上調(diào)GLUT4和PPAR-表達(dá)，無法有效激活I(lǐng)RS-2/P13K/磷酸化Akt信號通路.

　　綜上所述，本研究證實(shí)了刺五加多糖中、高劑量在改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝中的療效，同時(shí)能夠明顯降低氧化應(yīng)激水平，保護(hù)肝組織正常結(jié)構(gòu)和功能激活1RS2/P13K/磷酸化Akt信號通路和上調(diào)GLUT-4和PPAR-表達(dá)是其作用機(jī)制之一.

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