摘　要　土壤中硒的甲基化可能會導致硒的揮發，加劇土壤硒的流失，而農田土壤硒的缺乏會造成農作物中硒含量偏低. 施用硫肥是保障作物增產、增收的一種重要農藝措施，外源硫輸入對土壤硒的含量可能產生重要的調控作用. 本研究模擬稻田淹水環境，通過添加典型有機硫(甲硫氨酸)和無機硫(硫酸鈉)，測定硒的揮發量以及土壤中殘留的硒含量，以揭示外源硫輸入對土壤硒流失的影響機制. 結果顯示，外源性有機硫和無機硫的輸入均會促進土壤中硒的流失. 其中，甲硫氨酸的輸入會導致土壤總硒含量下降了15.9%−35.7%，這可能是由于甲硫氨酸向土壤提供甲基供體并促進硒的甲基化(土壤硒揮發量增加88.4%−308%);而添加硫酸鹽可能會促進土壤亞硒酸鹽的溶出，進而導致土壤總硒含量下降了4.67%−25.5%. 以上結果表明農田土壤播撒硫肥所引起的“硒流失”應予以重視.

　　關鍵詞　硒甲基化，硒流失，硫，稻田土壤.

　　硒是人體生長必需的礦質元素，可抗氧化、抗腫瘤、抗衰老，對維持人體新陳代謝和生命健康具有重要作用[1−3]. 農作物中的硒主要來自于土壤，土壤中硒的缺乏可能會影響農作物生理生長，并最終影響種植作物的產量[4]. 例如，低硒土壤中施加適量濃度的硒可以促進葉綠素的合成、增強抗氧化能力，從而促進農作物的生長和發育，顯著提高水稻(10%−14%)、小麥(6%−12%)、小白菜(22%)等農作物的產量[4−6].

　　此外，土壤硒的含量決定了谷物、蔬菜中硒的濃度[7]，土壤硒含量的不足會導致農作物硒含量偏低[8]. 我國被證實有一條低硒帶(小于0.175 mg·kg−1)，從東北部的黑龍江省延伸至西南部的云南省，覆蓋了我國約70%農田和約7億人口[9−13]. 人體硒的補充主要以膳食為主，缺硒可能會導致慢性軟骨病(大骨節病)、慢性心臟病(克山病)等人類缺硒疾病的發生[11−15]. 世界衛生組織建議人通過膳食攝入硒的量為50−200 μg·d−1，但目前多個國家和地區居民的硒攝入量普遍低于該推薦值，其中我國居民人均硒攝入量僅為44.4 μg·d−1[15−16]. 因此，關注土壤中硒含量對維系居民身體健康具有重要意義.

　　除了土壤成土母質和大氣沉降外，土壤總硒含量主要受到硒揮發的影響[11,18]：土壤中各種形態的有機硒或無機硒，在微生物(多種細菌、真菌和微藻)介導下被甲基化，生成揮發性二甲基硒和二甲基二硒醚，從而造成土壤中硒的流失[19−20]. 由于硒和硫同為氧族元素并具有相似的化學性質，土壤硒可能具有與硫類似的吸收、遷移和同化路徑，并可能發生相互競爭作用[21−22]，因此，硫可能會對土壤中硒的形態轉化產生重要調控作用.

　　例如，在陸地系統中，各種形態的硫先轉化成甲硫氨酸，并在甲硫氨酸裂解酶的作用下轉化為甲硫醇，然后以腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在甲基轉移酶的作用下轉化為二甲基硫，二甲基二硫醚則為甲硫醇的自動氧化產物，土壤硒可能也是通過競爭硫的甲基化通路以合成二甲基硒和二甲基二硒醚[23]. 此外，我國缺硫耕地面積超過總耕地面積的30%且逐年擴大[24]，硫肥施用是促進農作物增收、增產的重要農藝措施. 因此，有必要關注外源硫的輸入對土壤中硒的形態和含量的調控作用.

　　為了探究稻田土壤硒對外源硫輸入的響應，本研究模擬稻田淹水環境，通過添加典型有機硫(甲硫氨酸)和無機硫(硫酸鈉)，測定土壤硒揮發量以及土壤殘留硒含量，以揭示外源硫輸入對硒形態轉化的影響機制. 本研究將為土壤缺硒的原因提供科學認識，同時有助于全面評估硫肥施用帶來潛在風險，為制定科學、合理的農業措施提供支撐.

　　1 材料和方法(Materialsandmethods)

　　1.1 供試土壤

　　供試土壤采集自江蘇省宿遷市(34°45'7.52"N，118°27'49.64"E)某稻田的表層土壤(2−15 cm)，此地區位于低硒帶. 土壤于實驗室中自然風干，研磨均勻后過2 mm篩，保存于4 ℃冰箱中待用.

　　1.2 實驗設計

　　為探究有機硫和無機硫的輸入對土壤中硒甲基化和總硒含量的影響，本研究共設置了4個處理組×4個時間點×3個平行：(1)對照組，即僅向模擬的稻田水土體系中添加一定量的硒;(2)滅菌組，即向進行過滅菌處理(121℃、30 min)的水土體系中添加一定量的硒，以觀察微生物在硒形態轉化過程中起到的作用;(3)甲硫氨酸組，即向模擬的稻田水土體系中添加一定量的硒，并添加甲硫氨酸，以觀察甲硫氨酸對硒形態轉化的影響;(4)硫酸鹽組，即向模擬的稻田水土體系中添加一定量的硒，并添加硫酸鈉，以觀察硫酸鹽對硒的影響. 4個處理組中硒和硫的具體添加量. 選擇硫酸鹽和甲硫氨酸作為受試硫形態的原因是，前者為廣泛使用的無機硫肥，后者則是一種能促進農作物生長、控制水稻瘟病的含硫氨基酸有機肥料[24].

　　兩種形態硫的添加劑量均為3.3 nmol·L−1(以硫計)，相當于向土壤中輸入了528 mg·kg−1硫，這與我們收集的我國不同區域稻田土壤中溶解性硫酸鹽含量范圍基本一致(如9−1355mg·kg−1，未發表數據). 為防止因土壤硒老化而難以觀察到硒的響應，在所有處理組中添加了硒，添加的形態為亞硒酸鈉，含量為127 nmol·L−1(以硒計)，相當于向土壤中輸入了0.05 mg·kg−1的硒，遠低于土壤自身硒含量(0.26 mg·kg−1).

　　具體實驗操作過程如下：在20 mL頂空樣品瓶中加入1 g受試土壤，然后在厭氧手套箱中加入4.5 mL經過滅菌和脫氧處理的超純水(水土質量比為4.5∶1)，以模擬稻田淹水土壤體系. 添加完對應含量的硫酸鈉、甲硫氨酸以及亞硒酸鈉后，立即蓋緊瓶蓋，充分混勻，用錫紙包裹進行避光處理后，放置在厭氧箱手套中進行培養(25 ℃).

　　在第1、2、3天和第9天，進行樣品收集. 從厭氧手套箱中取出樣品瓶后，直接使用固相微萃取氣相色譜質譜聯用法從樣品瓶的頂端空氣中萃取揮發性硫甲基化產物和揮發性硒甲基化產物進行測定，測定的產物包括二甲基硫、二甲基二硫醚、二甲基硒、二甲基二硒醚和二甲基亞硒砜;其中，二甲基亞硒砜為二甲基二硫醚和二甲基二硒醚同時存在時以1∶1的比例反應生成的揮發性產物，因此，結果中提及的二甲基二硫醚產量是二甲基二硫醚與二甲基亞硒砜測定值的總和，二甲基二硒醚產量則是二甲基二硒醚與二甲基亞硒砜測定值的總和[25]. 測完頂端揮發性氣體后，在厭氧手套箱中將剩余水土全部轉移至50 mL離心管，離心(10 min，4000r·min−1)，留取土壤顆粒，用于測定土壤總硒含量.

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 揮發性有機硒和有機硫的測定

　　采用固相微萃取氣相色譜質譜聯用法SPME-GC-MSD (SPME-fiber, polydimethylsiloxane, Carboxen®;GC, Agilent 7890A; MSD, Agilent5977)，SPME萃取頂空樣品瓶中頂部氣體，測定培養過程中二甲基硫、二甲基二硫醚、二甲基硒、二甲基二硒醚和二甲基亞硒砜的揮發量(載氣：氦氣;氣流量：1 mL·min−1;柱子升溫程序：35℃保持4 min，后以7 ℃·min−1的速度升溫至140 ℃，再以25 ℃·min−1的速度升溫至280 ℃，維持1 min;進樣口溫度為300 ℃). 二甲基硫、二甲基二硫醚、二甲基硒以及二甲基二硒醚的加標回收率分別為88%−124%、88%−100%、92%−101%和85%−109%;由于自然環境中一般不存在純二甲基亞硒砜，且無法購買到純二甲基亞硒砜試劑，因此無法檢測其加標回收率. 二甲基亞硒砜的標準曲線是根據二甲基二硫醚和二甲基二硒醚的標準曲線并采用線性插值法計算而來[25].

　　1.3.2 土壤總硒的測定往土壤樣品中加入5 mL王水，并在微波消解儀(Milestone1200mega)中消解培養后剩余全部土壤[26].消解后將樣品轉移至50 mL離心管，用超純水定容至50 mL;離心(10 min，4000r·min−1)，過濾(0.45 µm)取上清液. 采用電感耦合等離子體串聯質譜儀(ICP−MS/MS，Agilent8800)測定上清液中總硒含量.

　　1.4 數據分析

　　通過IBM SPSS Statistics 22進行單因素標準差分析(one-way ANOVA);使用SigmaPlot 14.0進行圖形繪制.

　　2 結果與討論(Results)

　　2.1 外源硫的輸入對土壤硒甲基化的影響

　　土壤環境中硒和硫的甲基化是一個微生物介導的過程.硫的甲基化產物如揮發性二甲基硫和二甲基二硫醚以及硒的甲基化產物如揮發性二甲基硒和二甲基二硒醚均在對照組中檢測出.而在滅菌組中，未檢測到揮發性硒產生，且在整個培養期間與對照組相比存在顯著性差異(P<0.05);除第9天檢測到少量揮發性硫產生外，滅菌組中也未檢測到揮發性硫的產生，并在培養前期與對照組存在顯著性差異(P<0.05). 研究表明，在土壤和植物根際環境中，進入土壤介質的硒是在硒還原菌的作用下被進一步還原，發生甲基化作用，生成揮發性的二甲基硒、二甲基二硒醚和二甲基亞硒砜[27].

　　不同形態的硫對土壤中硒甲基化具有不同作用. 在微生物介導下，甲硫氨酸(有機硫)輸入可顯著促進硒甲基化，而硫酸鹽(無機硫)輸入則可顯著抑制硒甲基化. 甲硫氨酸輸入可顯著促進甲基化揮發性硒和硫的產生. 與對照組相比，甲硫氨酸處理組中揮發性甲基化硫的產量(以硫計)顯著增加9291%−263725%(P<0.05;揮發性甲基化硒產量(以硒計)從第2天起顯著增加88.4%−308%(P<0.05)，其中二甲基硒和二甲基二硒醚的揮發量分別增加了63.0%−149%和71.5%−4100%.

　　已有研究表明，土壤中含甲硫氨酸的物質的輸入能促進二甲基硫和二甲基二硫醚生成[28]，并能在土壤中檢測到二甲基硒和二甲基二硒醚[28]. 而硫酸鹽輸入可顯著抑制硒甲基化，對硫甲基化無顯著影響. 與對照組相比，硫酸鹽處理組中揮發性甲基化硒產量(以硒計)從第2天起顯著減少22.2%−61.4%(P<0.05)，其中二甲基硒揮發量減少29.0%，二甲基二硒醚揮發量減少17.7%−96.1%;而揮發性硫的總產量(以硫計)并沒有表現出顯著性差異(P<0.05)，這可能與高濃度亞硫酸鹽或硫酸鹽的輸入可幾乎完全抑制亞硒酸鹽產生二甲基硒化物有關[28]. 甲硫氨酸的輸入與硫酸鹽的輸入對于硒甲基化的影響存在顯著差異，其中，硫酸鹽組揮發性硒總產量僅為甲硫氨酸組的20.0%−42.4%，而硫酸鹽對揮發性硫產量并無促進作用，且硫酸鹽組揮發性硫總產量僅為甲硫氨酸組的0.079%−5.5%.

　　2.2 外源硫輸入對土壤總硒含量的影響

　　土壤環境中硒的遷移和轉化是一個微生物介導的過程. 對照組中土壤總硒含量從第3天起顯著高于滅菌組(4.73%−48.8%，P<0.05)，這表明微生物可能會影響硒在不同環境介質(如固相和液相)中的分配. 有研究表明，盡管亞硒酸鹽具有高水溶性，能溶解于土壤孔隙水或稻田上覆水中，但亞硒酸鹽還原菌等土壤微生物會促進亞硒酸鹽向元素硒的轉化，從而將亞硒酸鹽從水中去除，顯著增加硒在土壤介質中的分配[33−34].但這種分配作用可能還受到硫輸入影響，甲硫氨酸顯著促進土壤總硒含量下降，與對照組相比，除第2天外，甲硫氨酸組土壤總硒含量顯著減少15.9%−35.7%(P<0.05). 與對照組相比，硫酸鹽組土壤總硒含量在第9天顯著下降了25.5%(P<0.053.nbsp23p>0.05).甲硫氨酸和硫酸鹽的輸入都會顯著降低土壤總硒含量，但可能會存在不同驅動機制：

　　(1)甲硫氨酸輸入加劇硒流失，其原因在于，甲硫氨酸作為甲基供體對硒甲基化產生促進作用，從而促進了硒的揮發，最終導致土壤總硒含量下降. 需要說明的是，甲硫氨酸組中揮發性硒的增加量和土壤總硒的減少量并不相等. 這是由于實驗產生的二甲基硒和二甲基二硒醚無法同真實環境中一樣及時排放入大氣中，在厭氧土壤環境中發生反應，生成了其他形態的揮發性硒. 有研究發現，在厭氧條件下元素硒、硒酸鹽、亞硒酸鹽及硒代胱氨酸均可轉化為揮發性硒化氫[28];在厭氧沉積物中，產甲烷菌和硫酸鹽還原菌的作用之下，二甲基硒可以迅速去甲基化，轉化成甲烷、二氧化碳和硒化氫[35].

　　(2)硫酸鹽輸入加劇土壤硒流失，其可能的原因為：硫酸鹽的輸入可能抑制了高水溶性亞硒酸鹽向揮發性硒形態的轉化. 研究表明，無機硫肥的輸入可以減弱亞硒酸鹽在土壤中的吸附，并顯著促進土壤中亞硒酸鹽的溶出[28,36]. 在這個前提下，未被甲基化的亞硒酸鹽還可能進入非甲基化通路，有研究表明，在還原條件下，亞硒酸鹽在被微生物還原為不溶解的零價硒固定于土壤中后，可被微生物進一步還原為具有水溶性的硒化物[37]，這同樣也會減少硒在淹水環境條件下稻田土壤中的分配. 因此，即使硫酸鹽如上述抑制了硒甲基化，也會導致土壤硒流失.

　　需要強調的是，實際稻田環境是一個存在好氧厭氧條件交替的開放系統，但本研究(嚴格厭氧條件下的封閉體系)的結論仍然具有很好的指示意義：(1)在氧化性較高的好氧土壤環境中，亞硒酸鹽也會在厭氧區被逐漸還原[36]，其轉化通路與厭氧環境中的轉化通路差異較小. (2)實際的稻田土壤環境中有較為短暫的好氧期，研究表明，厭氧土壤樣品中亞硒酸鹽在礦物土壤上的吸附會隨著培養時間的增長而減少，而在好氧條件下亞硒酸鹽的吸附隨培養時間的增長而增加[36].

　　因此，在好氧厭氧交替條件下，溶解在稻田上覆水中的亞硒酸鹽含量可能會略低于嚴格厭氧條件，而土壤總硒含量則可能會略低于嚴格厭氧條件. (3)本研究為控制嚴格厭氧而設置了封閉體系，硒甲基化產物在揮發進入樣品瓶的頂端空氣后，無法排出體系外，揮發性硒出現了重新降解進入水相和固相介質的現象，其含量隨著培養時間的增長有所降低;實際稻田環境為開放體系，硒甲基化產生的揮發性產物可及時向大氣中揮發，揮發性硒的產量會更高. 由于水稻生長周期內根際土壤環境的厭氧期遠遠長于好氧期，前期好氧條件對土壤硒形態的干擾時期較為短暫，因此本研究的結論仍可很好地指示稻田淹水環境中硫輸入對硒的影響.在農業活動中，甲硫氨酸不僅可以促進植物生長，也可以控制水稻稻瘟病[37];而硫酸鹽則是土壤中一種最常見硫形態，所有的無機硫肥在施加進土壤后，必需先轉化成硫酸鹽才能被生物吸收和利用[34].

　　因此，在缺硒地區推廣甲硫氨酸以及使用無機硫肥需慎重考慮，硫肥施用可能是導致目前我國農田土壤普遍缺硒的重要影響因素之一，在低硒帶進行農業活動時應充分考慮硫輸入帶來的潛在負面影響.未來研究還可從以下幾個方面開展：(1)本研究供試土壤硫酸鹽含量充足，未來可對缺硫土壤進行探究，以驗證缺硫環境中硫肥施用對硒形態和含量的影響;(2)考察更多形態硫肥(如元素硫、硫酸鉀、硫包衣尿素等)的輸入對土壤中硒形態和含量的影響，以尋找普適性規律;(3)分析硒添加對土壤中硫形態及含量的影響，有助于同步解決土壤缺硒和缺硫問題.

　　3 結論(Conclusions)

　　(1)甲硫氨酸的輸入可促進硒甲基化，并提升硒的揮發量(88.4%−308%)，最終導致稻田土壤中硒含量下降(15.9%−35.7%).(2)硫酸鹽大量輸入雖然抑制了硒甲基化、降低硒的揮發量(22.1%−61.4%)，但仍然能夠導致土壤總硒含量下降(4.67%−25.5%).(3)在低硒帶稻田土壤中播撒含硫肥料時，應考慮硫肥在稻田可能引起的“硒流失”效應.

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　　作者：梁 宇1　周航宇1　劉 瑩2　唐雯莉1　鐘 寰1　雷 沛1,3,4