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草莓葉水提物對UVB致皮膚損傷的保護(hù)作用

時間:2021年03月24日 分類:醫(yī)學(xué)論文 次數(shù):

摘要為了評價草莓葉水提物(SLWE)延緩皮膚衰老功效,對SLWE成分、抗氧化活性、抑制非酶糖基化(NEG)能力進(jìn)行了測定;探討了SLWE對人包皮成纖維細(xì)胞(HFF-1)細(xì)胞活率、HFF-1中透明質(zhì)酸(HA)、人Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)、羥脯氨酸(HYP)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)

  摘要為了評價草莓葉水提物(SLWE)延緩皮膚衰老功效,對SLWE成分、抗氧化活性、抑制非酶糖基化(NEG)能力進(jìn)行了測定;探討了SLWE對人包皮成纖維細(xì)胞(HFF-1)細(xì)胞活率、HFF-1中透明質(zhì)酸(HA)、人Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)、羥脯氨酸(HYP)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)含量的影響。在中波紫外線(UVB)致HFF-1損傷模型基礎(chǔ)上,考察了SLWE對保護(hù)組活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、MMP-1和超氧化物歧化酶(SOD)的影響,探討SLWE對UVB致HFF-1損傷保護(hù)機制。結(jié)果表明,SLWE富含VC、槲皮素、綠原酸、沒食子酸及兒茶素類物質(zhì),其中,槲皮素含量12.86mg/L,表兒茶素含量10.13mg/L。SLWE自由基清除能力良好,清除不同自由基能力依次為O2-•>DPPH>ABTS>亞鐵離子螯合>•OH;體積分?jǐn)?shù)為1%的SLWE水溶液對NEG的抑制率為87.17%;體積分?jǐn)?shù)大于3%的SLWE水溶液可提高HFF-1中HA、COLI和HYP含量(P<0.05),體積分?jǐn)?shù)為6%的SLWE水溶液可降低MMP-1含量(P<0.01),表明SLWE具有提升皮膚含水量,增加膠原含量,抑制膠原降解,實現(xiàn)延緩衰老的功效;SLWE可有效降低因UVB刺激而產(chǎn)生的ROS,體積分?jǐn)?shù)6%的SLWE水溶液可顯著降MDA,抑制MMP-1表達(dá),提高SOD活力,說明SLWE有助于緩解氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷。

  關(guān)鍵詞草莓葉水提物;UVB;人包皮成纖維細(xì)胞;損傷保護(hù);延緩衰老;醫(yī)藥與日化原料

環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)

  成纖維細(xì)胞分泌的膠原纖維、彈性纖維及基質(zhì)成分,對維持皮膚正常生理狀態(tài)具有重要意義。皮膚經(jīng)紫外線長期或大量照射后,會引發(fā)光損傷[1],UVB刺激皮膚產(chǎn)生過多活性氧(ROS),激活細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化、線粒體及DNA受損、細(xì)胞膜通透性改變,成纖維細(xì)胞周期停滯和凋亡,進(jìn)而引起皮膚細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、彈性蛋白及透明質(zhì)酸降解,造成組織損傷,加速皮膚老化[1-2]。

  目前,針對草莓的精深加工主要集中在草莓果實,而草莓葉作為草莓生產(chǎn)過程的副產(chǎn)品,大多采用填埋、焚燒等處理方式,存在環(huán)境污染等問題。針對不同葉齡的草莓葉制作的草莓葉保健茶研究發(fā)現(xiàn),其含有大量VC、鞣花酸、可溶性糖、原花青素、槲皮素、兒茶素、游離氨基酸等,尤其是VC,其含量可高達(dá)每百克葉片160~170mg[3-4],具有良好的抗氧化活性及延緩衰老功效。但目前針對草莓葉提取物相關(guān)功效評價的研究較少,作用機制不明確。本研究制備了草莓葉水提物(SLWE),并對其進(jìn)行成分測定、抗氧化及延緩衰老功效評價,同時探討SLWE對UVB致成纖維細(xì)胞損傷保護(hù)機制,為其在延緩皮膚衰老方面的應(yīng)用提供依據(jù),推動草莓副產(chǎn)品價值的深入挖掘和應(yīng)用。

  1實驗部分

  1.1材料、試劑與儀器

  草莓(Fragaria×ananassa)葉片,北京欣寶萊科技有限公司提供。甲醇、乙腈、乙酸、pH2.5磷酸水溶液(色譜級),鹽酸氨基胍、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖、甲醇、醋酸鈉、無水三氯化鐵(FeCl3)、七水合硫酸亞鐵(FeSO4•7H2O)(以上均為AR),美國Sigma-Aldrich公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS),美國Hyclone公司;青鏈霉素混合液(100×)、胰酶-EDTA、小牛血清(FBS)(以上均為AR),美國ThermoFisher公司;CellCountingKit(CCK-8)試劑盒、活性氧(ROS)試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)、透明質(zhì)酸(HA)試劑盒,碧云天生物技術(shù)公司;丙二醛(MDA)檢測試劑盒、羥脯氨酸(HYP)試劑盒,南京建成生物研究所;人I型膠原(COLI)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、人基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)試劑盒、人基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)試劑盒,武漢華美生物有限公司;人包皮成纖維細(xì)胞(HFF-1),中國科學(xué)院干細(xì)胞庫;去離子水,自制。

  Agilent1220InfinityII液相色譜系統(tǒng),AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱(250mm×4.6mm×5µm),AgilentZORBAXSB-Aq柱(250mm×4.6mm×5µm),安捷倫科技(中國)有限公司;InfiniteM200PRO酶標(biāo)儀,瑞士Tecan公司;IX73研究級熒光倒置顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司;LGJ-18真空冷凍干燥機,北京松源華興科技發(fā)展有限公司;EB-160C/FC手持式紫外燈,美國Spectroline公司。

  1.2SLWE制備將新鮮草莓葉置于真空冷凍干燥機中,在真空度100Pa,功率1400W,-60℃條件下,干燥24h,冰上磨粉,過100目篩,得到草莓葉凍干粉。按料液比1:20(g:mL)加入草莓葉凍干粉和去離子水,在常溫(20℃),60Hz條件下超聲輔助浸提0.5h后,于8000r/min離心10min,離心處理2次,取黃綠色上清液,即為SLWE,用孔徑為0.22μm微孔濾膜過濾除菌,備用。

  1.3SLWE成分測定利用高效液相色譜儀對SLWE成分進(jìn)行測定,主要依據(jù)國標(biāo)或衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的方法。以VC為例,其測試原理為:以VC標(biāo)準(zhǔn)品和去離子水制備不同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)工作液,再對測試樣以色譜峰的保留時間定性,通過外標(biāo)法對其進(jìn)行定量。按照GB5009.86—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測定》第一法測定VC含量;按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)》保健食品功效成分及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗規(guī)范第二部分(十六)測定槲皮素含量;按照GB/T22250—2008《保健食品中綠原酸的測定》測定綠原酸含量;按照GB/T8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定沒食子酸和兒茶素類含量。

  1.4SLWE抗氧化活性測定

  1.4.1還原力測定

  采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)法[5],以0.1mmol/LTrolox為陽性對照,以自制去離子水稀釋,測定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.1%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%)水溶液的FRAP值。

  1.4.2自由基清除能力測定

  以自制去離子水稀釋,以VC(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)水溶液為陽性對照,參照XIE等[6]方法測定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.0%、100.00%)水溶液的DPPH•清除能力;參照RE等[7]方法測定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、10.00%、100.00%)水溶液的ABTS•清除能力;采用鄰苯三酚自氧化法[5],測定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的O2-•清除能力。采用YOU等[8]方法測定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、1.00%、2.50%、10.00%、100.00%)水溶液的•OH清除能力;以EDTA-2Na(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%)水溶液為陽性對照,參考GÜLÇIN[9]方法測定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的金屬離子螯合能力。

  1.5SLWE抑制非酶糖基化(NEG)能力

  參考莊秀園[10]的方法,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1g/L的鹽酸氨基胍水溶液為陽性對照,pH7.4PBS為空白對照,樣品自身熒光強度為樣品本底對照,以激發(fā)波長370nm和發(fā)射波長440nm檢測熒光強度,測定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、1.0%、10.0%、100.0%)對NEG的抑制率,按式(1)計算。NEG抑制率/%=[1-(A樣品-A樣品本底)/A空白]×100(1)1.6SLWE對正常生長HFF-1的影響1.6.1HFF-1細(xì)胞培養(yǎng)選擇生長狀態(tài)良好、對數(shù)生長期的HFF-1置于DMEM高糖培養(yǎng)基[含10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))、100U/mL青霉素鈉、100mg/L鏈霉素],于37℃、5%CO2(體積分?jǐn)?shù))、飽和濕度進(jìn)行培養(yǎng),每3d更換1次培養(yǎng)基。生長約80%融合時,V〔0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶〕:V(EDTA)=1:2培養(yǎng)基,進(jìn)行HFF-1傳代。

  2結(jié)果與討論

  2.1SLWE成分測定

  采用高效液相色譜法對SLWE中的VC、槲皮素、綠原酸、沒食子酸及兒茶素類進(jìn)行鑒定,SLWE富含VC、槲皮素、綠原酸、沒食子酸及兒茶素類,槲皮素含量最高,達(dá)12.86mg/L,表兒茶素10.13mg/L。研究發(fā)現(xiàn),兒茶素類是草莓葉中的主要抗氧化劑之一[12],同時草莓葉富含VC[13]、槲皮素[14-15]、沒食子酸[16-17]、綠原酸[18]等,均為已知抗氧化劑,說明SLWE具有作為抗氧化劑的可能。

  2.2SLWE抗氧化活性測定

  2.2.1還原力測定

  依據(jù)SLWE對Fe3+的還原力評價其抗氧化能力,擬合得到的FeSO4•7H2O回歸方程為y=0.3405x+0.0017(R2=0.998)。UVB損傷組HFF-1中MDA和MMP-1含量顯著提高,SOD酶活力顯著降低,說明UVB對HFF-1有明顯損傷作用,同時影響HFF-1清除ROS。與UVB損傷組相比,體積分?jǐn)?shù)為6%的SLWE水溶液可顯著降低MDA含量,抑制MMP-1表達(dá),提升SOD活力,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,說明SLWE對UVB致HFF-1損傷具有保護(hù)作用,同時可顯著提高細(xì)胞抗氧化能力,緩解氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷。

  醫(yī)學(xué)論文投稿刊物:《環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)》(月刊)創(chuàng)刊于1984年,創(chuàng)辦近20年來,一直被中國職業(yè)醫(yī)學(xué)界列為最重要學(xué)術(shù)期刊之一。2001年由李改為雙月刊,2002年正式更名為《環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)》。該刊載文量約40萬以上。省部級以上(包括國際性科研基金項目資助,已先后獲獎。

  3結(jié)論

  SLWE富含槲皮素、表兒茶素、VC等多種具有顯著抗氧化性成分,且具有良好的自由基清除能力。體積分?jǐn)?shù)大于0.3%的SLWE水溶液可有效去除細(xì)胞中的ROS,同時緩解由外源條件,如光照(UVB)等造成的細(xì)胞損傷,提高HA含量,提升皮膚含水量,為皮膚提供有利的組織環(huán)境;此外,SLWE具有促進(jìn)HYP和COLI表達(dá),增加膠原含量,抑制MMP-1表達(dá),減少膠原分解的功效,同時阻止膠原發(fā)生糖化反應(yīng)交聯(lián)變黃。因此,SLWE具有多角度全方位維持皮膚彈性、結(jié)構(gòu)和含水量,減少皮膚暗淡、松弛和皺紋。SLWE可作為一種良好的抗氧化和延緩衰老功效原料,可應(yīng)用于食品、保健品、化妝品等相關(guān)領(lǐng)域,促進(jìn)草莓葉“廢物利用”,挖掘草莓經(jīng)濟(jì)效益。

  參考文獻(xiàn):

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  [2]YINH(殷花),LINZN(林忠寧),ZHUW(朱偉).Mechanismsandpreventionofskinphotoaging[J].JournalofEnvironmentalandOccupationalMedicine(環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)),2014,31(7):565-569.

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  [4]WANGLN(王麗娜),CHANGLL(常琳琳),WANGGX(王桂霞),etal.AnalysisofnutrientcompoundsinStrawberryleavesbeforeandaftertheprocessing.AdvancesinstrawberryresearchIV[M]..Beijing:ChinaAgricuturePress(中國農(nóng)業(yè)出版社),2015:151-155.

  作者:董坤1,翟文麗1,王蘭青2,何聰芬

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