摘要:20世紀初“遺傳的染色體學說”的提出和證明標志著細胞遺傳學交叉學科建立，伴隨相關學科的發展，20世紀60年代末期細胞遺傳學又與分子遺傳學相結合，建立發展了分子細胞遺傳學交叉學科。分子細胞遺傳學以DNA分子原位雜交技術為核心，不斷拓展應用領域，為生命科學研究提供了直觀、高效的技術手段。原位雜交技術與基因組、細胞生物學等技術結合，被廣泛應用于人類、動物、植物的起源、進化、馴化等基礎研究和遠緣雜交、染色體工程等應用研究。通過形象地展示DNA、RNA、蛋白質在細胞中的實際位置，揭示DNA序列之間的實際位置和順序、親緣物種間的進化關系和結構重排、基因組拼接序列的質量、轉錄水平RNA和翻譯水平蛋白質的位置和數量變化等。江蘇省遺傳學會會員單位南京農業大學、揚州大學、南京林業大學、江蘇師范大學、徐淮地區農科院等自20世紀中期開展細胞遺傳學理論技術研究，伴隨學科發展不斷創新，建立了較完善的分子細胞遺傳技術體系，并成功應用于開展植物系統進化、遠緣雜交、染色體工程、基因組學等研究，取得了一批研究成果。本文將主要綜述江蘇省在該領域取得的重要進展，并展望未來發展方向。

　　關鍵詞:江蘇省遺傳學會;分子細胞遺傳學;DNA分子原位雜交;染色體工程;基因組學

　　20世紀初期，美國遺傳學家Sutton和德國生物學家Boveri提出“遺傳的染色體學說”，該學說的證明標志著細胞遺傳學的誕生和成熟。以美國康奈爾大學為核心的科學家利用玉米作為研究對象，闡明了植物性狀遺傳變異的細胞學基礎，建立和完善了植物細胞遺傳的理論和技術體系。日本的Kihara教授和美國的Sears教授以異源六倍體小麥(TriticumaesticumL.)及其祖先種為研究對象，建立了麥類植物細胞遺傳學技術，并將其應用于異源多倍體小麥的基因組分析、非整倍體創制和鑒定、小麥遠緣雜交等研究，闡明了小麥3個亞基因組的起源、麥類植物不同亞基因組染色體間的部分同源關系。此后，研究者們在很多植物物種中開展了細胞遺傳研究，建立了染色體核型分析、染色體構型分析和染色體分帶等經典細胞遺傳學核心技術，為物種的起源、系統分類、以及植物遺傳改良等提供了基礎的細胞學信息。

　　伴隨遺傳物質的發現、DNA雙螺旋結構解析、探針標記技術和顯微技術等不斷取得突破，分子遺傳學理論和技術快速發展，并向細胞遺傳學不斷滲透，20世紀60年代末期美國耶魯大學Gall等科學家在動物中建立的DNA分子原位雜交(insituhybridization,ISH)技術，成為分子細胞遺傳學這一分支學科建立的里程碑。該技術很快被用于植物細胞遺傳學研究，并得到快速發展和廣泛應用，為植物遺傳育種、基因組學和分子生物學研究提供了直觀有效的研究手段。ISH伴隨相關學科的發展不斷發展，雜交利用的探針分子可以是DNA、RNA和蛋白抗體;DNA探針包括基因組DNA、重復序列DNA、BAC等人工染色體克隆、單拷貝基因DNA、寡核苷酸探針庫等。

　　探針標記物包括放射性分子、半抗原、熒光素等;雜交的對象包括有絲分裂中期染色體、減數分裂粗線期或中期I染色體、間期核DNA纖維。由此建立了genomicinsituhybridization(GISH)、multi-colorfluorescenceinsituhybridization(FISH)、BAC-FISH、fibre-FISH、oligo-FISH、oligo-painting、immuno-staining、seqFISH、rmFISH等新技術，通過形象地展示DNA、RNA、蛋白質在細胞中的實際位置，揭示DNA序列之間的實際位置和順序、親緣物種間的進化關系和結構重排、基因組拼接序列的質量、轉錄水平RNA和翻譯水平蛋白質的位置和數量變化等。

　　江蘇省植物細胞遺傳學研究起步較早，覆蓋面廣，應用成效顯著。圍繞水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum、棉花(Gossypzumhirsutum)等主要作物以及瓜屬(Cucumis)、甘薯(Ipomoeabatatas)、菊屬(Chrysanthemum)、楊屬(Populus)園藝和林木植物，建立了完善的細胞學和分子細胞遺傳學研究體系，成功應用于遺傳改良、基因組解析和比較基因組、物種起源進化、染色體生物學等研究領域，取得了多項基礎和應用研究成果。在江蘇遺傳40周年之際，本文將回顧江蘇省遺傳學會會員單位圍繞主要糧食作物、園藝作物、林木等物種，在植物分子細胞遺傳學領域的重要研究進展，并展望該研究領域未來的發展方向。

　　1普通小麥(2n=6x=42，基因組AABBDD)是異源六倍體。小麥及其近緣物種染色體大，容易觀察其形態結構，因此成為早期植物細胞遺傳學研究的優良材料。Kihara教授建立基于遠緣雜交和細胞遺傳學技術的染色體組分析理論，闡明了栽培小麥A、B和D3個亞基因組以及其他小麥族物種的二倍體、四倍體祖先供體。Sears教授是小麥細胞遺傳學和染色體工程的先驅，20世紀30年代開始歷時40余年，先后培育出小麥單體、三體和缺體-四體及端體等非整倍體系列，將小麥3個染色體組的染色體根據其補償關系劃歸到7個部分同源群。

　　Gill教授實驗室建立了可識別全部21對小麥染色體的分帶技術(1991)[1];Rayburn和Gill[2~4]最早利用生物素標記的重復序列探針進行ISH，識別小麥染色體;Mukai等[5]建立基于重復序列的雙色ISH技術，可識別17對小麥染色體;Zhang等[6]建立以烏拉爾圖小麥A組和粗山羊草D組為探針、擬斯卑爾脫山羊草S組為封阻的GISH技術，可以區分普通小麥A、B、D3個亞基因組。

　　近年來，基因組測序技術的快速發展不僅為分子生物學研究提供了豐富的信息，同時也加快了植物分子細胞遺傳學的研究，尤其是用于小麥FISH的探針不斷發展，出現了寡核苷酸FISH、單拷貝基因FISH和基于單拷貝基因的寡核苷酸探針庫。此外，在小麥中還建立了基于流式細胞儀的染色體分揀、基于顯微切割的特定染色體區段切割分離等分子細胞遺傳學技術，用于結構和功能基因組研究[7~10]。建立的黑麥、大麥等的分子細胞遺傳學技術體系，為小麥與近緣物種的遠緣雜交、染色體工程和比較基因組研究提供了有效的技術手段。下面簡要介紹南京農業大學在小麥分子細胞遺傳學領域的研究進展。

　　1.1小麥及近緣物種染色體鑒定技術

　　染色體身份和染色體結構的準確快速鑒定是開展染色體工程、基因組分析等研究的重要基礎。早在20世紀80年代初期，江蘇省遺傳學會學會前理事長、南京農業大學細胞遺傳研究所劉大鈞院士帶領團隊，與Gill教授合作，開展小麥及其近緣物種染色體鑒定技術研究。先后在六倍體普通小麥、四倍體硬粒小麥、簇毛麥、大賴草、鵝觀草屬等物種中建立了染色體分帶技術[11~18];染色體分帶與染色體配對的構型分析結合，糾正了小麥4A和4B的身份[11]，初步分析我國特有半野生小麥的染色體組成，用于鑒定創制的硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體等遠緣種質[19,20]。20世紀90年代開始分子遺傳學研究。

　　建立了以生物素標記基因組DNA為探針的體細胞和花粉母細胞染色體GISH技術，明確了小麥-簇毛麥易位系中小麥和外源染色體的組成[21];從外源物種中克隆基因組特異重復序列,利用在簇毛麥中克隆的特異重復序列進行ISH，特異識別小麥背景中的簇毛麥染色體[22];建立了基于熒光素標記探針的GISH技術，用于鑒定導入小麥背景中的鵝觀草屬、賴草屬、黑麥、偃麥草等物種的染色體或染色體區段[23~30]，實驗室研究全面進入分子細胞遺傳學階段。重復序列探針的開發和熒光素標記技術的發展，為基于重復序列和雙色/多色FISH的核型分析提供了更快速精確的技術手段。

　　Zhang等[6]利用pSc119.2等4個質粒探針構建了簇毛麥品系91C43的FISH核型，并用于鑒定小麥-簇毛麥異附加系、代換系和易位系中外源染色體的具體身份;為提高FISH效率，Du等[31]開發了基于重復序列的寡核苷酸探針庫，并用于鑒定小麥品種、黑麥、偃麥草等染色體結構變異;王艷芝[32]開發了一批寡核苷酸探針用于替代原先的質粒探針，通過ND-FISH或FISH鑒定小麥染色體組成;進一步優化小麥、百薩偃麥草、黑麥等寡核苷酸探針套，建立栽培一粒小麥、硬粒小麥、荊州黑麥、長穗偃麥草等物種的標準核型，可快速鑒定小麥背景中的外源染色體，并構建建國以來我國373個大面積栽培品種及骨干親本高清核型，揭示其中存在的自發結構變異[31,33~35]。Guo等[36]利用寡核苷酸探針FISH分析了異花授粉黑麥品種染色體演化特征，并細胞學定位荊州黑麥毛頸基因區段。

　　Sun等[37]利用基于簇毛麥基因組序列新開發的寡核苷酸探針，結合利用4個已報道寡核苷酸探針，構建了簇毛麥不同品系的FISH核型，揭示了不同品系間的核型多態性。為解析外源染色體基因組序列，開發更多近緣物種特異重復序列探針和特異分子標記，克隆外源優異基因，與捷克Dolezel教授實驗室合作，利用流式細胞儀分揀了簇毛麥6VS和4VS染色體，Xiao等[38]在解析4VS序列基礎上，通過生物信息學鑒定出兩條反轉錄轉座子重復序列，經FISH分析發現均特異彌散分布于簇毛麥所有染色體上，雜交信號與GISH信號相似;Lei等[39]利用6VS染色體分揀測序獲得的基因組序列信息，開發了基于重復序列的7個寡聚核苷酸探針，將其中兩個探針相結合，進一步豐富了簇毛麥的FISH核型。

　　2水稻(2n=2x=24)是重要的糧食作物，基因組大小389Mb[67]，是禾本科作物中基因組最小的作物。水稻是最早完成基因組測序的作物，因此也成為作物學研究的模式物種。基因組大小與細胞核內的染色體大小一般呈正相關的關系，水稻染色體在禾本科作物中也屬于最小的類型之一，因此水稻細胞遺傳學相較于玉米、小麥起步較晚。

　　2.1水稻染色體鑒定技術由于水稻有絲分裂前中期染色體很小，不同染色體的大小十分接近，因此僅僅依靠形態特征很難完全準確辨別出水稻體細胞中的所有染色體。因此，在20世紀90年代以前，有關水稻核型中的染色體相對長度、臂比、核仁染色體等數據，不同研究者的結果不盡相同。后來研究者建立了基于減數分裂粗線期染色體的細胞學分析技術[68]，解決了體細胞染色體過短的問題。但傳統的粗線期染色體制片技術難度較大，需要發展更簡單有效的方法準確識別不同染色體，推進水稻的細胞遺傳學研究。

　　3甜瓜屬是葫蘆科重要的屬，包含52個物種，其中包括兩個重要的經濟作物，即從大約100億年以前的一個相同祖先分化而來的黃瓜(CucumissativusL.,2n=14,367Mb)和甜瓜(C.meloL.,2n=24,450Mb)[90]。甜瓜屬物種染色體相對較小，細胞遺傳研究起步較晚。甜瓜屬包括許多重要的野生種，具有栽培黃瓜和甜瓜所需的多種優良性狀，開展細胞遺傳研究，闡明物種間的進化關系，對于挖掘和利用野生種的優良性狀基因，推進甜瓜屬作物品種改良具有重要意義。

　　3.1甜瓜屬染色體鑒定技術甜瓜屬中黃瓜細胞遺傳學研究相對較多。黃瓜中期染色體較小，傳統細胞學技術難以準確描述和識別黃瓜染色體，染色體分帶技術在黃瓜染色體鑒定中起到了不可替代的作用，其中以C帶在黃瓜中應用最為廣泛。Chen等[91]利用改良的染色體制片技術和C帶技術建立了黃瓜的有絲分裂中期染色體核型，但黃瓜中期染色體較短，C帶分辨率不高，難以準確識別黃瓜每條染色體。錢春桃等[92]采用放線菌酮預處理活體種子根改進制片技術，獲得了清晰的黃瓜前中期染色體C帶帶型。

　　4棉花(Gossypzumhirsutum,2n=4x=AADD=52)是重要的纖維作物，也是重要的植物油脂和植物蛋白質來源。目前世界上廣為栽培的棉花為異源四倍體種，為紡織工業提供了90%以上的棉纖維。棉屬有52個種，包括45個二倍體種，根據親緣關系分成A-G和K等8個基因組(其中2個為A組栽培種)以及7個由AD基因組組成的異源四倍體種(含2個為栽培種)，是改良栽培棉花的重要基因資源，通過遠緣雜交轉移和利用外源基因對于棉花改良有重要意義。

　　4.1棉花染色體鑒定技術

　　棉花染色體數量多，形態相似且較短小，未建立染色體分帶等核型分析技術，因而難以準確識別特定染色體。GISH技術提供了有效鑒定手段。以野生種斯特提棉(G.sturtianumWillis)為探針，在陸地棉(G.hirsutumL)標準系TM-1體細胞有絲分裂中期染色體上進行GISH，可以鑒定出栽培棉中的外源染色體[111]。以A1基因組的阿非利加草棉(G.herbaceumLvar.africanum)和C1基因組的斯特提棉兩個棉種的DNA同時為探針進行GISH，可以清晰地區分At、Dt和C1基因組染色體，且重復性好，這一棉花多色GISH技術體系成功應用于種間雜種的鑒定[111]。對引自澳大利亞CSIRO的陸地棉與澳洲棉(G.australeF.v.M.)(G2基因組)六倍體雜種(基因組組成為AtAtDtDtG2G2)進行的多色GISH，可清晰地區分At、Dt和G2基因組染色體[111]。

　　Wang等[112~114]開發了基于棉花連鎖群(染色體)的特異BAC克隆，獲得第一套多倍體植物四倍體棉染色體特異的BAC克隆，利用BAC-FISH雜交信號可作為染色體特異的細胞學標記，準確地識別出棉花26條染色體。Wang等[114]利用棉花高密度遺傳圖譜的SSR分子標記篩選出了20個BAC克隆，與45S和5SrDNA相結合，構成了由22個探針混合形成的雞尾酒式文庫，以亞洲棉江陵中棉有絲分裂中期染色體為靶標，一次FISH產生的信號可以同時識別亞洲棉的13對染色體，且與陸地棉A染色體亞組的部分同源染色體一一對應，獲得了亞洲棉穩定可靠的標準核型，實現了亞洲棉染色體的準確識別。

　　植物方向論文范例：植物精油對提高葡萄抗寒性的影響研究

　　5菊科(Compositae)春黃菊族(Anthemideae)菊屬(Chrysanthemum)的菊屬約有43個種和18個變種(亞種)，它們以染色體基數9形成一個從二倍體到十倍體的多倍體系列。其中菊花(C.morifoliumRamat.)為多年生草本植物，是我國十大傳統名花和世界四大切花之一，觀賞和經濟價值極高。栽培菊花大多為六倍體及非整倍體，具有高度雜合、自交不親和及近交衰退等特性。我國是栽培菊花的起源中心，但原有商業主栽品種多為國外引進，抗蚜蟲性、耐低/高溫性差和種性退化等成為限制我國菊花產業發展的瓶頸。開展菊花分子細胞遺傳學研究對于探究菊花起源與演化、菊屬種間親緣關系以及利用遠緣雜交拓寬菊花遺傳基礎具有重大意義。

　　作者：王海燕1，龔志云2，蔣甲福1，周寶良1，婁群峰1，曹清河3，席夢利4，陳佩度1，顧銘洪2，張天真6，陳發棣1，陳勁楓1，李宗蕓5，王秀娥1*