摘要為了解小眼畸形相關轉錄因子mitf基因在魚類早期體色褪黑過程中的調控作用，本研究采用RACE技術獲得橘色雙冠麗魚(Amphilophuscitrinellus)mitf基因cDNA序列全長，利用qRT-PCR技術檢測其在橘色雙冠麗魚胚胎不同發育時期、體色褪黑不同時期和各個組織中的表達規律。獲得mitf基因2個亞型，其中，mitf1的cDNA全長為1816bp，包括5′非編碼區(UTR)158bp、3′UTR428bp、開放閱讀框(ORF)1230bp，共編碼409個氨基酸;mitf2的cDNA全長為1638bp，5´UTR長160bp，3´UTR長428bp，ORF長1050bp，共編碼349個氨基酸。同源性和系統進化分析顯示，mitf1和mitf2聚在一小支，與慈鯛科(Cichlidae)魚類同源性最高，與哺乳類動物同源性較低。qRT-PCR結果顯示，在成魚各個組織中mitf1和mitf2均有不同程度表達，其中，眼部表達量最高且顯著高于其他組織(P<0.05)，肌肉、腦和腎臟也有較高表達;mitf1和mitf2在胚胎各個發育時期均有表達，在受精卵時期表達量最高，顯著高于其他胚胎期;隨著橘色雙冠麗魚體色由黑色過渡到橘黃色，mitf1和mitf2在魚皮膚、鱗片、尾鰭中的表達均呈逐漸下降趨勢，表明mitf基因表達與魚體色由黑到黃轉變的表型間存在關聯性，推測與魚體色發育階段色素細胞的分化和分布比例的動態變化相關。本研究通過了解魚類體色發育和變異的分子基礎，可為魚類色素細胞發育和體色人工改良積累資料。

　　關鍵詞橘色雙冠麗魚;小眼畸形相關轉錄因子(MITF);qRT-PCR;黑色素細胞

　　MITF(Microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)即小眼畸形相關轉錄因子，由Hertwig(1942)于放射誘導的突變小鼠中發現，突變體的后代會出現小眼畸形、早發性耳聾、皮毛和虹膜色素減退等癥狀。MITF是動物皮膚、眼睛和羽毛色素中黑色素細胞發育的關鍵調控因子(Linetal,2019)，具有基本–螺旋–環–亮氨酸拉鏈(Basichelix-loop-helix-leucinezipper,bHLHZip)結構，以二聚體的形式與絡氨酸家族啟動子Mbox高度結合，通過直接調控dct、tyr、tyrp1、c-kit和bcl2等基因的表達，從而在黑色素細胞的發育、存活、遷移、增殖和分化過程中發揮重要作用(Steingrimssonetal,2004)。在哺乳動物中，mitf基因的突變或缺失可能會導致動物耳朵、眼睛、毛發、體色等表型發生改變，如鵪鶉(Coturnix)白色羽毛的產生(Minvielleetal,2010);馬(Equuscaballus)(Hauswirthetal,2019)和犬(Canislupusfamiliaris)(Korbergetal,2014)皮毛白色斑點的出現等。

　　在魚類中，mitf作為治療黑色素瘤潛在的靶基因，已在斑馬魚(Daniorerio)中開展了大量研究(Listeretal,2014)，在東方鲀(Lietal,2013)、錦鯉(Cyprinuscarpio)(Liuetal,2015)、鯽魚(Carassiusauratus,redvar.)(Zhangetal,2017)等魚類中也開展了mitfa在胚胎和各個成魚組織中表達情況的研究，初步探索了mitfa在魚類體色形成過程中的作用，但其具體的調控機制及與其他體色相關基因的聯級作用仍未被闡明。橘色雙冠麗魚(Amphilophuscitrinellus)，俗稱紅魔鬼，原產于中南美洲的尼加拉瓜、哥斯達黎加等地，是一種既可食用又可觀賞的大型熱帶魚類(Barluengaetal,2010;Kauttetal,2012)。通常1齡可達性成熟，成熟后的麗魚體色為橘紅色或橘色，生產上常將其作為父本與紅頭麗魚(Cichlasomasynspilum)雜交，產生更具觀賞性的子一代血鸚鵡魚(♂A.citrinellus×♀C.synspilum)。

　　橘色雙冠麗魚在發育過程中會出現體色過渡的現象，體色由最初黑色過渡至灰色，灰色再過渡至亮黃色，這一現象稱為體色褪黑(蔣燕玲,2016)，主要是由于色素細胞的形成、增殖、遷移和分化所致。橘色雙冠麗魚含4種色素細胞，包括黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞和虹彩細胞，其中，紅色素細胞和虹彩細胞只在特定部位分布且數量較少，黑色素細胞和黃色素細胞在“黑色–灰色–黃色”3個時期均有分布，孵化后至體色由黑到黃的轉變過程中，黑色素細胞數量呈逐漸增加而后又減少的趨勢，黃色素細胞數量則呈一直增加趨勢(韋敏俠等,2015)。

　　目前，國內外對魚類早期體色褪黑這一復雜生物學過程的研究相對較少，其調控機制仍不明確。魚類體色的形成和分布主要是由其體表鱗片和皮膚中色素細胞的類型、分布和數量所決定(Shietal, 2015;Yuetal,2012)，目前，已在魚類中鑒定出6種色素細胞，包括黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、虹彩細胞、白色素細胞和藍色素細胞(Volkeningetal,2018)。其中，黑色素細胞分布最為廣泛，含有大量的黑色素顆粒，能夠吸收特定波長的入射光，使魚的顏色呈現黑色/灰色(Zhangetal,2017)。

　　黑色素細胞起源于外胚層神經嵴細胞，由神經嵴細胞經黑素母細胞、黑素干細胞發育至成黑色素細胞(Cohenetal,2016)，黑色素細胞的形成受一系列通路和基因的嚴格調控(Houetal,2008)，其中，MC1R/α-MSH信號通路(Newtonetal,2007)、PI3K/Akt信號通路(Khaledetal,2002)、MAPK信號通路(Wangetal,2017)、WNT/β-catenin信號通路(Yamadaetal,2010)、NO信號通路(Parketal,2009)為最常見的5條信號通路，mitf作為這5條通路共有的靶向基因，直接關聯黑色素細胞發育所必需的多個基因的表達，包括dct、tyr、c-kit和bcl2等，對黑色素細胞存活、遷移、增殖和分化起著關鍵性作用(Steingrimssonetal,2004)。本研究擬聚焦黑色素合成關鍵基因mitf，檢測其在橘色雙冠麗魚各組織、胚胎發育各時期和體色褪黑轉換期的表達模式，了解其在魚類體色褪黑調控中的作用規律。

　　1材料與方法

　　1.1實驗材料

　　橘色雙冠麗魚取自中國水產科學研究院珠江水產研究所。選取性成熟且體色為橘色的健康雙親進行配對，獲取不同發育時期的胚胎，包括受精卵、卵裂期、原腸期、神經期、視泡期、聽泡期、心臟形成期、血液循環期等8個時期胚胎(蔣燕玲,2016)。在體色發育的3個褪色階段“黑色、灰白、黃色”各取3尾魚，剝離鱗片、皮膚和尾鰭。同樣選取性成熟且體色為淡黃色的橘色雙冠麗魚3尾，分離鰓、腦、肌肉、性腺、眼、腎、心臟等7個組織。所取材料均用Trizol保存，置于–80℃冰箱保存，用于RNA提取和熒光定量分析。

　　1.2實驗方法

　　1.2.1mitf基因

　　cDNA全長克隆取性成熟橘色雙冠麗魚皮膚、鱗片、尾鰭于Trizol中，按TissueRNAKit(OMEGA)試劑盒操作步驟提取總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和SynergyTMNEOHTS多功能酶標儀檢測RNA的完整性、純度及濃度。利用Prime ScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa)反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，置于–20℃冰箱保存。根據已知慈鯛科(Cichlidae)魚類保守序列，利用Primer5.0軟件設計擴增引物mitf-F和mitf-R，以cDNA第一鏈為模板，擴增目的基因片段。

　　25μL擴增體系：16.75μLddH2O，4μLdNTPMIXS，2.5μL10×Buffer，0.5μL模板，上下游引物各0.5μL，0.25μLrTaq酶;反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35個循環，72℃后延伸5min。PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，擴增產物送廣州艾基生物有限公司進行測序。

　　根據測序結果設計mitf5′race和3′race巢氏引物，通過SmarterRace5′/3′KitComponents(TaKaRa)試劑盒進行5′末端和3′末端序列擴增。擴增后PCR產物進行膠回收、連菌、37℃培養過夜，挑選陽性克隆進行測序。利用軟件VectorNTI將mitf5′端、3′端及其中間序列拼接，從而獲得橘色雙冠麗魚完整mitfcDNA序列。

　　2結果

　　2.1橘色雙冠麗魚

　　mitf基因cDNA全長和氨基酸序列分析獲得橘色雙冠麗魚mitf基因2個亞型mitf1和mitf2，其中，mitf1cDNA全長為1816bp，5′UTR長158bp，3′UTR長428bp，開放閱讀框(ORF)為1230bp，共編碼409個氨基酸。預測其蛋白質分子量為39.1kDa，理論等電點為5.23，親水性系數為–0.603。TMHMM2.0查找發現無跨膜結構。磷酸化位點分析顯示，該蛋白包含27個絲氨酸(S)磷酸化位點、9個蘇氨酸(T)磷酸化位點、5個絡氨酸(Y)磷酸化位點。使用SOPAMA預測蛋白二級結構，其中，α螺旋結構131個(占37.01%)，β折疊22個(占6.21%)，無規則卷曲結構177個(占50%)，延展鏈結構24個(占6.78%)。

　　mitf2的cDNA全長為1638bp，5′UTR長160bp，3´UTR長428bp，ORF為1050bp，共編碼349個氨基酸。預測其蛋白質分子量為38.5kDa，理論等電點為5.23，親水系數為–0.645。mitf1和mitf2氨基酸序列比對結果顯示，mitf1亞型氨基酸序列與mitf2亞型相比，在0~53的位置多53個氨基酸，82~86的位置多5個氨基酸，其余位置完全相同。TMHMM2.0查找發現無跨膜結構。

　　磷酸化位點分析顯示，該蛋白包含27絲氨酸(S)磷酸化位點、9個蘇氨酸(T)磷酸化位點、5個絡氨酸(Y)磷酸化位點。使用SOPAMA預測蛋白二級結構，其中，α螺旋結構142個(占40.69%)，β折疊14個(占4.01%)，無規則卷曲結構174個(占49.86%)，延展鏈結構19個(占5.44%)。與mitf1蛋白二級結構相比，除在0~53和82~86位置多出氨基酸及個別位點結構不同外，二級結構基本一致。

　　2.2mitf基因同源比對和系統進化樹分析

　　橘色雙冠麗魚2個亞型mitf1和mitf2的bHLHzip結構氨基酸序列與大多數物種高度一致，表明bHLHzip結構在進化過程中較為保守。利用MegAlign軟件分析橘色雙冠麗魚mitf基因氨基酸序列與其他物種的同源性，結果顯示，橘色雙冠麗魚mitf1氨基酸序列與斑馬擬麗魚(Maylandiazebra)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和薩伊藍六間(Cyphotilapiafrontosa)等魚類同源性最高，分別為90.7%、91.9%和93%，與其他硬骨魚類如大黃魚(Larimichthyscrocea)、斑魚(Channaargus)和孔雀魚(Poeciliareticulata)也有較高的同源性，分別達到了85.6%、87.4%和82.1%，而與人(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)、雞(Gallusgallus)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)則相對較低，只有60%、60.9%、58.9%和63.1%。

　　3討論

　　3.1mitf基因的cDNA全長和氨基酸序列分析

　　通過Race技術獲得橘色雙冠麗魚mitf基因cDNA全長，2個亞型MITF1和MITF2均具有3個結構域：靠近N末端的MITF_TFEB_C_3_N結構域、bHLHZip結構域和一個未知功能結構域(DUF3371)。bHLHZip結構域作為MITF蛋白的功能區域，在進化過程中高度保守，其中，HLHZip區域能夠與自身或色素細胞的形成、增殖、遷移和分化起著重要的調控作用，而mitfb不參與黑色素細胞的發育，只在眼色素上皮細胞中表達，參與眼調控的發育(Listeretal,2014)。

　　本研究克隆的mitf1和mitf2為mitf基因2個亞型，均屬于mitfa亞型，理化性質分析結果顯示，mitf1和mitf2的蛋白質二級結構極為相似，熒光定量結果顯示，mitf1和mitf2除了在胚胎期表達量有差異外，在各個組織和各轉換時期表達量變化趨勢基本一致，因此，推測mitf1和mitf2更多地保留了mitfa基因功能，未出現明顯基因功能分化。同源比對發現，橘色雙冠麗魚mitf1、mitf2與尼加拉瓜湖始麗魚、薩伊藍六間、斑魚等魚類具有較高的同源性，與哺乳類、鳥類、爬行類等同源性較低，符合橘色雙冠麗魚傳統進化地位。

　　3.2mitf基因表達差異分析

　　3.2.1mitf基因在胚胎發育時期的表達

　　mitf1和mitf2在橘色雙冠麗魚8個胚胎發育時期均有表達，其中，在受精卵時期表達量最高，顯著高于其他發育期(P<0.05)，表現出明顯的時期特異性。研究發現，mitf基因也在其他動物胚胎發育期開始表達，但表達的時期較晚，如非洲爪蟾胚胎在21/22期開始表達(Kumasakaetal,2010)，雞(Mochiietal,1998)和鼠(Musmusculus)(Nakayamaetal,1998)胚胎則在5日齡和9.5日齡開始表達。

　　生物學論文投稿刊物：《基因組學與應用生物學》主要刊登現代生物技術的前沿學科和基礎學科如基因組學、分子細胞遺傳學、生化與分子生物學、基礎醫學和應用生物學等相關的原始研究成果。刊登人類、動物、微生物及植物領域在組織、器官、細胞、染色體、蛋白質、基因、酶和發酵工程等不同水平上的現代生物技術等基礎與應用基礎研究成果。

　　在青鳉魚中，mitf基因在胚胎整個發育過程中最早表達于2細胞期，這與橘色雙冠麗魚表達模式相類似(Lietal,2013)。蔣燕玲等(2016)對橘色雙冠麗魚胚胎組織學觀察發現，黑色素細胞在血液循環期才開始出現，而mitf在受精卵時期即出現高表達現象，結合前人報道，推測魚類發育早期mitf不僅調節黑色素細胞分化和發育，對視網膜色素上皮細胞、破骨細胞和肥大細胞中也有不同程度的調控作用(Baueretal,2009)。在卵裂期，mitf1、mitf2基因表達量驟減，mitf1隨胚胎發育表達量繼續降低直至聽泡期驟升后又繼續下降，而mitf2隨胚胎發育表達量逐漸升高直至血液循環期，仍呈現上升趨勢，預示mitf基因可能在黑色素細胞的發育過程中扮演著十分重要的角色。

　　參考文獻

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　　作者：陳旭東1,2鄔國強1,2宋紅梅2①汪學杰2牟希東2劉奕2劉超2胡隱昌2