摘要：茶樹為山茶屬多年生常綠木本植物，內(nèi)含茶葉多酚類物質(zhì)具有廣泛的應(yīng)用。然而在茶樹組織培養(yǎng)過(guò)程中，褐化是一個(gè)棘手的問(wèn)題，阻礙茶樹快繁體系的建立。為研究茶樹外植體褐化過(guò)程中的分子機(jī)制，以輕、重兩種不同褐化程度的茶樹外植體為研究材料，運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和功能分析，共篩選出872個(gè)差異表達(dá)基因(DifferentiallyExpressedGenes，DEGs)，其中507個(gè)顯著上調(diào)，365個(gè)顯著下調(diào)。通過(guò)GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)DEGs進(jìn)行功能注釋分析，顯示茶樹組培褐化過(guò)程中與衰老、酶氧化和脂膜代謝等過(guò)程密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在872個(gè)DEGs中，2個(gè)酶褐化相關(guān)基因、2個(gè)細(xì)胞色素P450轉(zhuǎn)錄因子和2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)水平在兩個(gè)樣本間顯著差異調(diào)控。因此，本研究發(fā)現(xiàn)了茶樹葉片在組培過(guò)程中與酶促褐化相關(guān)的潛在基因，為解析茶樹組織培養(yǎng)褐化過(guò)程的分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵字：茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.);褐化;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;組培

　　茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)為山茶屬多年生常綠木本植物，內(nèi)含茶多酚、氨基酸、咖啡堿等多種對(duì)人體有益的物質(zhì)，具有降脂減肥(袁野等,2016)、抗氧化(郭金龍,2010)、助消化和調(diào)理腸胃(屠幼英等,2002;呂曉華等,2017;李解等,2015)等功效，是世界三大無(wú)酒精飲料之一。近年來(lái)，隨著國(guó)家鄉(xiāng)村振興和扶貧產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，茶葉產(chǎn)業(yè)得到穩(wěn)步提升，茶樹新品種在茶葉加工、品質(zhì)形成過(guò)程中的作用與日俱增，產(chǎn)業(yè)對(duì)于優(yōu)良無(wú)性系茶苗的需求也更為迫切。茶樹組培快繁體系具有周期短、繁殖系數(shù)高、易繼承親本的優(yōu)良性狀等優(yōu)勢(shì)，但茶樹內(nèi)含較高的多酚類物質(zhì)，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，成為茶樹快繁體系的瓶頸。

　　目前，研究者通過(guò)篩選植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(邱璐等,2000)，運(yùn)用各類抗氧化劑和吸附劑(黃燕芬等,2009)，改善茶樹組培過(guò)程中的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)環(huán)境(鄔秀宏等,2012)等技術(shù)手段能夠降低和延緩褐化影響，但褐化損傷的分子機(jī)尚不清楚，問(wèn)題也未得到實(shí)質(zhì)性解決。隨著Illumina測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究者開展了關(guān)于植物褐化分子調(diào)控機(jī)理的研究，Gao等(2020)在牡丹組織培養(yǎng)愈傷組織褐變的遺傳調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，包括MYB、bHLH和WRKY在內(nèi)的6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以及包括PsCYP71A、PsI2ʹH、PsSTH-21、PsUGT和PsGST在內(nèi)的其他基因可能參與調(diào)節(jié)牡丹愈傷組織褐變。

　　Zhou等(2020)通過(guò)對(duì)低溫貯藏過(guò)程中褐變的“旺角”梨核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出5121個(gè)DEGs(DifferentiallyExpressedGenes)，并進(jìn)行功能注釋，鑒定出一些參與氧化還原反應(yīng)、膜脂代謝和酶褐變的褐變相關(guān)DEGs。本研究利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)輕、重兩種不同褐化程度的茶樹葉片外植體進(jìn)行研究重兩種不同褐化程度的茶樹葉片外植體進(jìn)行研究，篩選影響茶樹外植體褐化的相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析和功能鑒定，以期發(fā)掘茶樹葉片在組培過(guò)程中與褐化相關(guān)的潛在基因，為解析茶樹組織培養(yǎng)褐化過(guò)程的分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和參考基因比對(duì)結(jié)果

　　通過(guò)對(duì)不同程度褐化的茶樹葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序獲得Rawreads，經(jīng)過(guò)Rawreads數(shù)據(jù)過(guò)濾，獲得Cleanreads和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。輕度褐化組(LightBrowning，LB)和重度褐化組(HeavyBrowning，HB)分別獲得46864566、45008534條Cleanreads，樣品Q20、Q30值均分別高于97%、93%，且與參考基因組對(duì)比率達(dá)到89%以上，其中與基因組外顯子區(qū)域的reads數(shù)對(duì)比率高于60%，表明此次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序錯(cuò)誤率低、整體測(cè)序質(zhì)量高、與參考基因組比對(duì)覆蓋率高，可以進(jìn)行下一步分析。

　　1.2差異基因分析

　　以|log2(FoldChange)|>0&padj<0.05為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)不同程度褐化樣品的DEGs進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)篩選所得的DEGs數(shù)量，檢測(cè)所得差異表達(dá)基因?yàn)?72個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的有507個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有365個(gè)。表明茶樹組培葉片在褐化程度不斷加深的過(guò)程中，組培葉片的部分調(diào)控機(jī)制伴隨發(fā)生改變。

　　1.3差異基因的GO功能富集分析

　　對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能注釋，872個(gè)差異基因中被富集在620個(gè)GO功能類別，選取主要富集的30個(gè)GO功能條目，其中，屬于生物過(guò)程的主要有光合作用(Photosynthesis)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(Responsetooxidativestress)、小分子分解代謝過(guò)程(Smallmoleculecatabolicprocess)、細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程(Cellularcarbohydratemetabolicprocess)以及多元醇等多個(gè)分解代謝過(guò)程(Catabolicprocess)。

　　屬于細(xì)胞組成的主要有光系統(tǒng)(Photosystem)、光合膜(Photosyntheticmembrane)、類囊體(Thylakoid)、光系統(tǒng)I(PhotosystemI)、光系統(tǒng)II(PhotosystemII)，且差異基因均為下調(diào)表達(dá);屬于分子功能的主要有輔因子結(jié)合(Cofactorbinding)、血紅素結(jié)合(Hemebinding)、輔酶結(jié)合(Coenzymebinding)、氧化還原酶活性(Oxidoreductaseactivity,)、抗氧化活性(Antioxidantactivity)、水解酶活性(Hydrolaseactivity)。

　　1.4差異基因的KEGG富集分析

　　通過(guò)對(duì)872個(gè)DEGs進(jìn)行KEGGPathway富集分析，發(fā)現(xiàn)共有116個(gè)差異基因被注釋到74個(gè)通路中，DEGs注釋率為13.3%。其中主要富集下調(diào)表達(dá)的有光合作用(Photosynthesis)10個(gè)基因、光合作用-觸角蛋白(Photosynthesis-antennaproteins)6個(gè)基因，上調(diào)表達(dá)的有類黃酮生物合成(Flavonoidbiosynthesis)8個(gè)基因、苯丙素生物合成(Phenylpropanoidbiosynthesis)11個(gè)基因、二萜類生物合成(Diterpenoidbiosynthesis)3個(gè)基因、酪氨酸代謝(Tyrosinemetabolism)3個(gè)基因、苯丙氨酸代謝(Phenylalaninemetabolism)2個(gè)基因。

　　2討論

　　基因表達(dá)具有時(shí)間特異性，茶樹葉片組織培養(yǎng)過(guò)程中，不同程度褐化條件下，存在表達(dá)水平顯著差異的基因或轉(zhuǎn)錄本。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)褐化程度輕、重的茶樹組培葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選所得差異表達(dá)基因?yàn)?72個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的有507個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有365個(gè)，這些基因大多數(shù)參與生物過(guò)程，如代謝、細(xì)胞過(guò)程和生物過(guò)程，其中多數(shù)具有催化活性和結(jié)合功能。

　　KEGG通路分析表明，注釋基因主要參與光合作用、類黃酮生物合成、苯丙素生物合成、二萜類生物合成、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝。以上結(jié)果表明，在組培葉片褐化過(guò)程中存在氧化還原狀態(tài)、脂膜穩(wěn)定性和底物組成的一些變化，這些結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致，即植物褐化與許多過(guò)程相關(guān)，包括衰老、酶氧化和脂膜代謝等過(guò)程(Dongetal.,2015;Francketal.,2006;Linetal.,2016)。苯丙烷代謝途徑中的酚類合成受幾種關(guān)鍵酶的調(diào)控，包括PAL(Phenylalanineammonia-lyase)、CHS(Chalconesynthase)和CHI(Chalconeisomerase)，是植物體內(nèi)多酚和黃酮類化合物形成的重要開關(guān)，當(dāng)新鮮切割的植物組織暴露于外界空氣中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致組織褐變(Alegriaetal.,2016;Suehiroetal.,2014)。

　　茶樹中苯酚和醛的合成也始于苯丙烷途徑衍生的苯丙烷，由苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為查爾酮和一系列酶催化共同完成，本研究在872個(gè)差異基因中，對(duì)組培葉片褐化可能相關(guān)的幾種關(guān)鍵酶PPO(Polyphenoloxidase)、PAL(Phenylalanineammonia-lyase)(李南羿等,2009)和Tyrosinase(Wichersetal.,2003)相關(guān)基因進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示PPO等基因表達(dá)量在褐化程度輕、重的2個(gè)樣品中未呈現(xiàn)與前人研究結(jié)果相似的趨勢(shì)。

　　但實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)到苯丙氨酸代謝中AMP-binding(TEA034012)、酪氨酸代謝中ADH_N(TEA007219)2個(gè)酶相關(guān)基因表達(dá)活性與褐化程度具有明顯的關(guān)聯(lián)性，二者在茶樹組培褐化過(guò)程中基因的上調(diào)高表達(dá)與褐化程度呈正相關(guān)規(guī)律。細(xì)胞色素P450在植物體內(nèi)黃酮生物合成中起著重要作用。有研究表明，細(xì)胞色素P450相關(guān)基因表達(dá)量與植物組織褐變呈正相關(guān)規(guī)律，研究者分別在荷花與蝴蝶蘭實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致荷花組織和蝴蝶蘭外植體的褐化(Wangetal.,2013;Xuetal.,2015)。

　　本研究中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)細(xì)胞色素P450轉(zhuǎn)錄因子基因(TEA033874、TEA030439)與茶樹組培葉片褐化相關(guān)，且均表現(xiàn)為基因高表達(dá)與組織褐化程度加深的規(guī)律，這與前人的研究結(jié)果保持一致。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是增加活性氧途徑中相關(guān)植物基因在生物、非生物和氧化應(yīng)激反應(yīng)中表達(dá)的重要誘導(dǎo)因子(Eulgemetal.,2007;Eulgemetal.,2000)。Zhang等(2019)在綠色核桃殼褐變研究中發(fā)現(xiàn)，一個(gè)含有保守WRKY結(jié)構(gòu)域以及C2H2型鋅指的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在褐變綠色核桃殼中顯著表達(dá)，證實(shí)了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與植物組織褐變的相關(guān)性。

　　與前人的研究相互印證，本研究中我們發(fā)現(xiàn)2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因(TEA027312、TEA023720)上調(diào)高表達(dá)與組織葉片褐化程度表現(xiàn)為正相關(guān)規(guī)律，首次揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與茶樹組培褐化程度的相關(guān)性。而針對(duì)候選基因與茶樹組培的褐化程度有因果關(guān)系，還需后續(xù)對(duì)基因的結(jié)構(gòu)和功能表征研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。本研究比較了不同褐化程度茶樹組培之間的轉(zhuǎn)錄組，共篩選出872個(gè)差異表達(dá)基因，其中顯著上調(diào)507個(gè)，顯著下調(diào)365個(gè)。通過(guò)GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋分析，顯示茶樹組培褐化過(guò)程中與衰老、酶氧化和脂膜代謝等過(guò)程相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在872個(gè)差異基因中，2個(gè)酶褐化相關(guān)基因、2個(gè)細(xì)胞色素P450轉(zhuǎn)錄因子和2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)水平在兩個(gè)樣本間顯著差異調(diào)控。本研究為解析茶樹組織培養(yǎng)褐化過(guò)程的分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

　　茶葉種植論文范例：唐代長(zhǎng)江流域的茶葉種植與飲茶習(xí)俗

　　3材料與方法

　　3.1試驗(yàn)材料

　　選取重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹資源圃(105º89’20’’E，29º38’04’’N)栽種的福鼎大白茶為供試材料，以當(dāng)年生健康無(wú)病蟲害的同株茶樹葉片作為外植體，經(jīng)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得茶樹葉片組培褐化材料。以褐化面積小于葉片面積1/3的樣本作為輕度褐化組選擇不同程度褐化茶樹葉片作為輕度褐化組(LightBrowning，LB)，以褐化面積大于葉片面積2/3的樣本作為重度褐化組(HeavyBrowningBrowning，HB)，液氮速凍，保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，為了排除誤差干擾，樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含4-5個(gè)組培葉片。

　　參考文獻(xiàn)：

　　AlegriaC.,GoncalvesE.M.,Moldao-MartinsM.,Cisneros-ZevallosL.,andAbreuM.,2016,Peelremovalimprovesqualitywithoutantioxidantloss,throughwound-inducedphenolicbiosynthesisinshreddedcarrot,PostharvestBiology&Technology,120:232-239

　　DongY.,LiuL.Q.,ZhaoZ.,ZhiH.H.,andGuanJ.F.,2015,Effectsof1-mcponreactiveoxygenspecies,polyphenoloxidaseactivity,andcellularultra-structureofcoretissuein'yali'pear(pyrusbretschneiderirehd.)duringstorage,HorticultureEnvironment&Biotechnology,56(2),:207-215

　　EulgemT.,andSomssichI.E.,2007,NetworksofWRKYtranscriptionfactorsindefensesignaling,Curr.opin.plantBiol,10(4):366-371

　　EulgemT.,RushtonP.J.,RobatzekS.,andSomssichI.E.,2000,TheWRKYsuperfamilyofplanttranscriptionfactors,TrendsinPlantence,5(5):199-206

　　作者：李解1,2翟秀明1,2楊娟1,2唐敏1,2*侯渝嘉1,2*