摘要：目的：探討云南小粒咖啡類黑精的抗氧化能力和減肥功能。方法：用熱水提取法提取中烘焙度云南小粒咖啡中的類黑精(M總)，再將提取的類黑精產物按分子質量大小分成>100kDa(M，)、10～100kDa(M：)、<10kDa(M3)3個部分。用羥自由基、1，1-二苯基.2.三硝基苯肼(1，1.diphenyl一2.picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率和總還原力評價M總、M，、M：、M，的抗氧化能力;通過飼喂高脂飼料建立大鼠肥胖模型，檢測不同質量濃度咖啡類黑精對肥胖大鼠體質量、體脂質量、血脂水平、脂體比、脂肪組織形態、肝臟組織形態等指標的影響。

　　結果：相同質量濃度下，云南小粒咖啡類黑精不同分子質量產物自由基清除能力和總還原力不同：不同劑量處理組咖啡類黑精均能降低大鼠體質量、體脂質量：肝組織切片顯示，中、高劑量處理組大鼠肝臟組織結構完整、肝細胞大小一致、胞漿均勻、細胞核清晰;脂肪組織切片顯示，高劑量處理組大鼠脂肪細胞較模型組減小，且排列均勻、結構完整。結論：云南小粒咖啡類黑精及不同分子質量產物均具有不同程度抗氧化能力;高質量濃度(72g/100mL)云南小粒咖啡類黑精具有一定的減肥作用，能抑制大鼠體質量的增加，減少肝臟內脂肪堆積，對肝臟具有一定的保護作用。

　　關鍵詞：云南小粒咖啡：類黑精;抗氧化作用;減肥功能

　　咖啡原產于非洲埃塞俄比亞，從植物學上來說，是茜草科咖啡屬，最早對其進行食用和栽培的是阿拉伯人Ⅲ。國際上通常根據咖啡果實顆粒的大小，將咖啡的三大原種劃分為大粒種咖啡、中粒種咖啡、小粒種咖啡【2】。中國有98%的咖啡出自云南。云南種植的主要是小粒咖啡，具有“濃而不苦、香而不烈、略帶果酸味”的獨特特點。云南小粒咖啡因其獨特的風味而深受消費者喜愛，隨著人們生活水平、健康意識的提升，云南小粒咖啡的活性成分及其生理功能也備受矚目。然而不同烘焙度咖啡的香氣和口感也不一樣，一般認為烘焙程度較低時，咖啡口感較酸，烘焙程度較高，咖啡口感較苦，適合的烘焙程度，能釋放出咖啡豆的最大香氣。

　　周斌掣如的研究表明，云南小粒咖啡采用中烘焙度時口感和香氣較好。咖啡類黑精是咖啡豆在烘焙過程中，咖啡豆中的羰基和氨基化合物發生美拉德反應所形成的一類結構復雜、聚合度不等的棕褐色、大分子聚合物的混合體H。5】。由于其結構復雜，Bekedam等[6-7]在研究咖啡類黑精分子結構時，采用美拉德反應中間體的結構性能模型系統，將咖啡類黑精分為低分子質量(<3kDa)和高分子質量(>12kDa)類黑精，發現低分子質量類黑精中含有咖啡因、綠原酸和一些含氮小分子物質，高分子質量類黑精中含有阿拉伯半乳聚糖、酚基、蛋白質等物質。在功能研究中，通常使用<10kDa濾膜超濾分離類黑精來研究其功能，發現分子質量<10kDa咖啡類黑精具有抗氧化、降血壓、抗菌活性、改善腸道微環境和結合風味物質等功能哺。21。

　　分子質量>10kDa的類黑精抗氧化功能尚未受到關注。目前，國內關于云南小粒咖啡多為其咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿等生物活性物質功能的研究;烘焙條件、萃取方法對咖啡豆揮發性成分分析;烘焙條件、種植環境對云南小粒咖啡感官、品質的影響，針對云南小粒咖啡類黑精生理功能的報道較少。為研究云南小粒咖啡類黑精減肥降脂功能及不同分子質量產物抗氧化能力差異，本實驗通過提取云南小粒咖啡類黑精及不同分子質量產物(<10、10～100、>100kDa)，用羥自由基、1，1-二苯基一2.三硝基苯肼(1，1-diphenyl一2.picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除力和總還原力來評價類黑精及分級產物抗氧化能力差異;運用大鼠構建肥胖模型，研究類黑精的減肥降脂功能，以期為云南小粒咖啡產品及功能食品開發提供科學依據。

　　1材料與方法

　　1.1動物、材料與試劑

　　選用清潔級雄性SD大鼠70只，體質量(260±20)g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(滇)2015.0002。基礎詞料：從昆明醫科大學實驗動物中心購置，依照GB14924.3—2010《實驗動物配合飼料營養成分》¨糾配制，每lkg基礎飼料主要含碳水化合物550g、脂肪50g、灰分70g、蛋白質220g、纖維素50g。

　　高熱量飼料為實驗室配制，參照“國食藥監保化【2012】107號”附件8《減肥功能評價方法》高熱量模型飼料配方，每5kg高熱量飼料按基礎詞料3.5kg、蔗糖0.75kg、豬油0.75kg配比制成，烘干待用。中烘焙度的云南小粒咖啡豆，均從云南本土市場購買。二氯甲烷、抗壞血酸、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、乙醚、甲醛、二甲苯、無水硫酸鈉、DPPH美國Sigma公司。

　　1.2儀器與設備

　　722分光光度計、CTl4D11臺式高速離心機、732型紫外分光光度計、全自動樣品快速研磨儀、冷凍干燥機美國Labconco公司;Minimate切向流超濾系統美國頗爾公司;415R高速冷凍離心機德國Eppendorf公司：Cobasc311全自動生化分析儀德國羅氏診斷有限公司;RM2235切片機、ASP300S脫水機、DM750顯微鏡德國LEICA公司。

　　1.3方法

　　1.3.1咖啡類黑精的提取分離及純化

　　提取參考Bekedam等H41的方法并加以改進，稱取中烘焙度的云南小粒咖啡豆100g，用粉碎機粉碎至粒徑0.2～O.4mm顆粒，備用。將研磨好的咖啡粉30g添加到90℃的180g去離子水中，并在90℃水浴中連續攪拌15min，冷卻后用布氏漏斗過濾，濾液用二氯甲烷脫脂，于40℃水浴鍋中去除二氯甲烷后，將樣品預凍后用冷凍干燥機制成凍干樣品并稱其質量，過濾后的咖啡渣重復上述操作3次。將中烘焙度的云南小粒咖啡類黑精樣品(M總)配制成2g/100rnL的溶液，用0.2“m的濾膜片過濾后，分別用100、10kDa的濾膜分級截留得到截留液和濾出液“51，濾出液重復超濾4次，每次吸取截留液后用10mL去離子水洗濾3次，以減少樣品殘留，將最終收集的截留液和濾出液預凍后冷凍干燥，分別得到分子質量為>100、10～lOO、<10kDa的咖啡類黑精M1、M2、M3。

　　以二氯甲烷為溶劑，用索氏提取器進行純化，脫除類黑精樣品中的咖啡因n61。將提取的中烘焙度云南小粒咖啡類黑精樣品放入索氏提取器的濾紙筒中，加入30mL二氯甲烷，再向圓底燒瓶中加入80mLZ.氯甲烷，42℃水浴加熱回流提取8h，隨后更換新的二氯甲烷80mL，再繼續抽提，當濾紙筒邊緣不析出白色晶體時，結束回流提取，揮發干類黑精樣品中的二氯甲烷，待用。

　　1.3.2清除DPPH自由基能力測定

　　參考其他物質DPPH自由基清除力測定方法¨7。211，精密稱取DPPH78.9mg，用無水乙醇定容至50mL，搖勻后得到濃度為4mmol/L的DPPH母液。使用時將DPPH母液用無水乙醇稀釋，工作液濃度為0.1mmol/L。將不同分子質量樣品用無水乙醇稀釋為質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L的溶液，取不同質量濃度樣品溶液2mL，于EP管中進行以下3組反應：2mL無水乙醇與2mLDPPH溶液混合;2mL樣品溶液與2mLDPPH溶液混合;2mL樣品溶液與2mL無水乙醇混合。分別搖勻，避光反應30rain。使用紫外.可見分光光度計在517nm波長處測量各體系吸光度¨7‘211。實驗平行進行3次，取平均值，根據式(1)計算DPPH自由基清除率。清腳%=生之半Ⅷ。式中：A。為2mL乙醇與2mLDPPH溶液的吸光度;A.為2mL樣品溶液與2mLDPPH溶液的吸光度;A：為2mL樣品溶液與2mL無水乙醇的吸光度。

　　1.3.3清除羥自由基能力測定

　　參考其他物質羥自由基清除能力測定方法旺2。271，將不同分子質量樣品用蒸餾水溶解，配制成質量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L的溶液，取5支試管，依次標記為1～5，各試管中分別加入不同質量濃度樣液2mL，再按順序依次加入9mmol/L水楊酸。乙醇溶液2mL、9mmol/LFeSO。溶液2mL，最后加入8.8mmol/LH，0，溶液2mL啟動反應，室溫反應1h后，在510nm波長處測定各待測液的吸光度Ax，以蒸餾水為空白對照4。考慮到樣品本身的吸光度，另取5支試管，各試管中分別加入不同質量濃度樣液2mL、9mmol/L水楊酸一乙醇溶液2mL、9mmol/LFeSO。為空白對照液的吸光度;A。為加入類黑精后的吸光度;Ax。為不)JWI-I：0：的類黑精溶液本底吸光度。

　　1.3.4總還原力測定

　　參考Benjakul等佇鼬的方法，采用鐵氰化鉀法測定總還原力。取不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L)溶液2.5mL于離心管中，再依次加入2.5mL0.2mol/LpH6.6磷酸鹽緩沖液、2.5mL質量分數1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50℃水浴中反應20rain，取出后立即用冷水冷卻，并加入2.5mL質量分數10%三氯乙酸溶液，混勻后于5000r/min離心10min。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL質量分數0.1%FeCl，溶液，混勻室溫靜置10rain，700rim波長處測定其吸光度口91，吸光度越高表示樣品的還原力越強。

　　1.3.5咖啡類黑精對肥胖大鼠的減肥作用

　　1.3.5.1實驗動物造模

　　選取精神狀態良好、無異常的70只SD大鼠進入動物房，飼養環境：溫度20～25℃，相對濕度40%～65%及光照12hid，基礎飼料適應性飼養7d，適應期結束后稱其體質量，參照“國食藥監保化[20121107號”附件8《減肥功能評價方法》，按照大鼠體質量，將其隨機分成2組，其中10只大鼠作為空白對照組給予基礎飼料，60只大鼠作為模型組給予高熱量飼料。實驗過程中，每周記錄給食量、撒食量、剩食量，稱量體質量1次。喂養2周后，給予高熱量飼料的60只大鼠按體質量增量排序，淘汰1/3體質量增量較低的大鼠，對組內余下的40只大鼠繼續飼喂高熱量飼料。飼喂6周后，測量體質量進行統計分析，模型組的大鼠體質量超過空白對照組大鼠體質量20%，空白對照組體質量和增質量與模型組相比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，肥胖模型成功。

　　1.3.5.2實驗動物的分組及受試樣品的給予

　　造模成功后將40只肥胖大鼠依據體質量按照隨機區組法分成4組，分別是模型組和低、中、高3個劑量處理組，各組間大鼠的體質量差異無統計學意義(P>0.05)。模型對照組和3個劑量處理組給予高熱量飼料，空白對照組給予基礎飼料。中度烘焙的云南小粒咖啡類黑精劑量按人均體質量(60kg)、每天飲用純咖啡30g、中度焙烤咖啡中熱水提取類黑精占咖啡干物質的24%計算。中度烘焙的云南小粒咖啡類黑精攝入量為120mg/(kg·dm。)，以人體攝入量的5倍(0.6g/(kg。dmb))、10倍(1.2g/(kg‘dmb))、30倍(3.68/(kg·drab))劑量進行灌胃(0.5mldlOOg)，通過計算得到低、中、高3個劑量處理組樣品質量濃度分別為12、24、72g/100mL，配制后當天使用。空白對照組和模型組給予生理鹽水，灌胃劑量為0.5mL/100g。受試樣品給予時間6周，每周記錄給食量、撒食量、剩食量，并稱量體質量1次。實驗結束時禁食不禁水16h，稱體質量，乙醚麻醉，股動脈采血，采血后盡快分離血清，測定血清總膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白一膽固醇(10wdensitylipoprotein—cholesterol，LDL.C)、高密度脂蛋白.膽固醇(highdensitylipoprotein.cholesterol，HDL.C)的水平口01。解剖大鼠，取腹腔脂肪及各臟器并稱質量，計算脂體比。大鼠肝臟、腹腔脂肪用體積分數10%甲醛溶液固定口1。321。

　　1.3.5.3觀察指標及測定體質量：每周測定1次，反映中度烘焙的云南小粒咖啡類黑精減肥效果。

　　2結果與分析

　　2.1云南小粒咖啡類黑精的提取及抗氧化性

　　2.1.1咖啡類黑精對DPPH自由基的清除作用

　　云南小粒咖啡類黑精中分子質量<10kDa(M，)對DPPH自由基的清除效果與未分離的云南小粒咖啡類黑精(M總)對DPPH自由基的清除效果最為相近，均呈現較強的清除能力，云南小粒咖啡類黑精中分子質量>100kDa(M，)對DPPH自由基的清除效果較M總、M：、M，弱。總體來看，質量濃度在0.4～0.8g/L時，DPPH自由基清除率隨質量濃度增加而增加，而0.8--1.0g/L其清除率呈下降趨勢。

　　研究報道，小分子類黑精產物呈現較強清除DPPH自由基能力，可能是因為美拉德反應中形成的色素類物質提供氫與DPPH反應，還可能因為這些小分子化合物以非共價鍵的形式連接在類黑精骨架上，分級之后小分子物質解離出來暴露更多的羥基，使得清除DPPH的能力增強【】81。本研究發現云南小粒咖啡小分子質量類黑精呈現較強的清除DPPH能力，同時發現未分級類黑精及分子質量為10～100kDa的類黑精均呈現較強清除DPPH自由基能力，具體機制有待進一步研究。

　　2.1.2咖啡類黑精對羥自由基的清除能力

　　云南小粒咖啡類黑精中分子質量>100kDa(M，)對羥自由基的清除能力較M”M溺。未分離類黑精及分子質量為10～100kDa和<10kDa的類黑精對羥自由基的清除能力隨質量濃度的增加而增強，其質量濃度在1.O～4.0g/Lpq呈線性增強。Delgado.Andrade等口卸在咖啡類黑精抗氧化研究中發現，咖啡類黑精骨架上小分子復合物的抗氧化性更強。本研究發現除分子質量>100kDa的類黑精以外，其他類黑精及其分級產物均有較強清除羥自由基的能力。提示對于云南小粒咖啡，類黑精分子質量<100kDa的產品及功能食品也可以作為未來開發的關注點。

　　3結論

　　云南小粒咖啡類黑精及不同分子質量產物均有一定清除DPPH自由基和羥自由基的能力。在相同質量濃度下，對DPPH自由基的清除能力由高到低依次為：M總>M，>M：>M，，對羥自由基的清除能力由高到低依次為：M總>M3>M：>M】。采用鐵氰化鉀測定類黑精及不同分子質量產物的總還原力，結果表明，M總、M。、M，、M，均具備良好的抗氧化活性，總還原力由高到低依次為：M3>M2>M總>MI。肥胖模型建立成功后，對肥胖大鼠給予受試樣品，結果顯示：1)云南小粒咖啡類黑精具有一定的減肥作用，能抑制大鼠體質量的增加及減少肥胖大鼠體脂含量;2)高劑量處理組云南小粒咖啡類黑精能夠提高大鼠HDL.C水平，對HDL.C有較好的保護作用;3)中劑量處理組和高劑量處理組云南小粒咖啡類黑精對實驗大鼠的肝臟有較好的保護作用，能促進脂肪代謝，能較好地改善肝內脂肪堆積的癥狀。

　　食品方向論文范文：食品添加劑在食品業的應用及安全對策

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