摘要:按照NCII遺傳交配設(shè)計(jì)構(gòu)建測交群體，考察包括產(chǎn)量性狀在內(nèi)的9個(gè)農(nóng)藝性狀，對水稻農(nóng)藝性狀表型、配合力和雜種優(yōu)勢進(jìn)行通路分析，以期為水稻品種的培育和改良提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明，主穗實(shí)粒數(shù)與生物調(diào)控、千粒重與半胱氨酸和蛋氨酸代謝、主穗長與SNARE相關(guān)囊泡運(yùn)動(dòng)、主穗一/二次枝梗與依賴DNA的轉(zhuǎn)錄、株高與大分子代謝過程、主穗穎花數(shù)與花粉識別、有效穗數(shù)與水解酶活性、單株實(shí)粒重與嘌呤核苷結(jié)合等通路相關(guān)。為獲得優(yōu)良性狀，高配合力，雜種優(yōu)勢可以從某一性狀的相關(guān)通路進(jìn)行研究，找到調(diào)控該通路的相關(guān)基因，以期為改良水稻一般配合力和獲得雜種優(yōu)勢提供一定幫助。

　　關(guān)鍵詞:雜交水稻;GWAS;通路分析;配合力;雜種優(yōu)勢

　　水稻論文投稿刊物：中國水稻科學(xué)所設(shè)欄目包括研究報(bào)告、研究簡報(bào)、研究快報(bào)、研究簡訊、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、學(xué)術(shù)專論、文獻(xiàn)綜述等。《中國水稻科學(xué)》堅(jiān)持科學(xué)技術(shù)面向經(jīng)濟(jì)建設(shè)的方針和雙百方針辦刊，以盡量多地發(fā)表高質(zhì)量的論文為辦刊的出發(fā)點(diǎn)，以把刊物辦成“對外開放型”的學(xué)術(shù)期刊為辦刊目標(biāo)，進(jìn)行著不懈的努力。

　　水稻農(nóng)藝性狀包括株高、穗長、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗實(shí)粒數(shù)和千粒重等，通過研究和改良農(nóng)藝性狀可以提高產(chǎn)量，培育高產(chǎn)品種。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，水稻全基因組測序的完成成為水稻品種改良重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genomewideassociationstudy，GWAS)是一種對全基因組范圍內(nèi)常見遺傳變異(單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù))總體關(guān)聯(lián)分析的方法。自植物中第一篇使用高分辨GWAS鑒定數(shù)量性狀相關(guān)基因/QTL的報(bào)道[1]以來，在水稻中進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析的報(bào)道越來越多，Yonemaru等[2]對抽穗期、粒長、千粒重、籽粒表面積、每穗粒數(shù)、抗病6個(gè)產(chǎn)量相關(guān)的性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定到8個(gè)顯著相關(guān)位點(diǎn)。Huang等[3]對517份實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行高通量測序，對株高等14個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行GWAS分析，鑒定出了37個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)，且每個(gè)位點(diǎn)能夠解釋大約36%的表型變異，給水稻的遺傳育種研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。

　　GWAS的出現(xiàn)加快了學(xué)者對各種性狀遺傳機(jī)制的認(rèn)識，但該方法也存在以下局限性[4]:(1)目前，GWAS利用SNP芯片技術(shù)檢測的SNP大多是根據(jù)高密度單倍型圖譜數(shù)據(jù)得來的，或者是以一定物理位置間隔選擇的SNP。因此，關(guān)聯(lián)分析所獲得的SNP位點(diǎn)不一定真正與性狀有關(guān)，或位置有所偏差。(2)為防止假陽性關(guān)聯(lián)，GWAS分析采用非常嚴(yán)格的P值，因而很可能漏掉一些P值未達(dá)到GWAS要求的閾值但實(shí)際上有關(guān)聯(lián)的SNP。(3)GWAS分析通常局限于單個(gè)位點(diǎn)的邊際效應(yīng)[5]，但很多性狀的調(diào)控機(jī)制是由多個(gè)基因相互作用引起的。針對GWAS存在的缺點(diǎn)，也出現(xiàn)了很多相應(yīng)的方法。如基于Wang等[6]提出的多位點(diǎn)隨機(jī)SNP效應(yīng)混合模型方法，編寫了mrMLM軟件包(https://cran.rproject.org/web/packages/mrMLM/index.html)。Hirschhorn[7]提出了基于通路的研究方法，利用基因功能、代謝通路等相關(guān)信息對GWAS結(jié)果進(jìn)行深入挖掘。當(dāng)前以SNP為對象的GWAS通路分析算法分為非核算法和核算法兩大類[8]，其中非核算法主要包括基因功能富集分析(genesetenrichmentanalysis，GSEA)和分層貝葉斯優(yōu)取(hierarchicalBayesprioritization，HBP)，核算法包括線性核(linearkernel，LIN)、狀態(tài)認(rèn)證核(identity-by-statuskernel，IBS)和尺度不變核(poweredexponentialkernel，PEK)。

　　GSEA是目前GWAS通路分析最常用的方法之一，GSEA的結(jié)論基于一組相關(guān)基因而非單個(gè)基因，因此富集分析增加了研究的可靠性，且能識別出與生物現(xiàn)象最相關(guān)的生物過程，相比于單基因方法更有利于得到有意義的通路;同時(shí)比基于經(jīng)典完備統(tǒng)計(jì)學(xué)理論的結(jié)果更穩(wěn)定可靠。目前，通路分析法在水稻中的研究較少，張遠(yuǎn)森[9]用GSEA方法檢測出103個(gè)通路與14個(gè)水稻農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，其中質(zhì)體通路與抽穗天數(shù)、小穗數(shù)和分蘗數(shù)等13個(gè)水稻農(nóng)藝性狀相關(guān)。此外，水稻一般配合力的高低與雜種優(yōu)勢對于是否能獲得優(yōu)良水稻品種同樣重要。NorthCarolinadesignII(NCII)設(shè)計(jì)被廣泛認(rèn)為是進(jìn)行配合力和雜種優(yōu)勢研究的經(jīng)典遺傳設(shè)計(jì)[10]。Liu等[11]利用廣陸矮4號和特青產(chǎn)生的F2回交群體與不育系，按NCII設(shè)計(jì)進(jìn)行測交。發(fā)現(xiàn)一般配合力較低的親本，子代的株高、抽穗期、穎花數(shù)這3個(gè)性狀反而呈現(xiàn)超表達(dá)，且其一般配合力效應(yīng)顯著上升。

　　我們前期研究[10]用三系野敗型雜交水稻的恢復(fù)系和微核心種質(zhì)構(gòu)成的品種群體，按照NCII遺傳交配設(shè)計(jì)，分別與5個(gè)不育系測交，分析親本一般配合力與相對競爭優(yōu)勢的相關(guān)性，表明親本一般配合力之和與相對競爭優(yōu)勢在千粒重、株高、主穗二次枝梗數(shù)、主穗實(shí)粒數(shù)、主穗一次枝梗數(shù)、主穗穎花數(shù)性狀間均呈極顯著正相關(guān)。付新民等[12]利用野敗型雄性不育系和恢復(fù)系，按照NCII遺傳交配設(shè)計(jì)表明，在水稻培育中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同性狀考慮不育系和恢復(fù)系對農(nóng)藝性狀的影響，進(jìn)一步提高雜交水稻的雜種優(yōu)勢水平。

　　梁康逕[13]采用包括現(xiàn)今生產(chǎn)上大面積推廣的秈型恢復(fù)系在內(nèi)組成的秈粳雜交水稻遺傳群體，按NCII設(shè)計(jì)，主要分析其穗部性狀的雜種優(yōu)勢的遺傳規(guī)律，建議適當(dāng)擴(kuò)大雙親的遺傳差異，以保持雜種優(yōu)勢水平，并與培育目標(biāo)和組合測配特點(diǎn)相結(jié)合，有效地培育適合不同環(huán)境或特定環(huán)境的超高產(chǎn)組合。盡管關(guān)于水稻農(nóng)藝性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析、基于NCII遺傳設(shè)計(jì)的水稻配合力和雜種優(yōu)勢的研究很多，但是關(guān)于水稻農(nóng)藝性狀配合力和雜種優(yōu)勢的全基因組通路分析還未見報(bào)道。農(nóng)藝性狀的配合力和雜種優(yōu)勢，均類似于農(nóng)藝性狀表型本身，為數(shù)量性狀，受多個(gè)基因控制。本研究按照NCII遺傳交配設(shè)計(jì)，構(gòu)建測交群體，考察包括產(chǎn)量性狀在內(nèi)的9個(gè)農(nóng)藝性狀，對水稻農(nóng)藝性狀表型、配合力和雜種優(yōu)勢進(jìn)行通路分析，以期為水稻品種的培育和改良提供一定的理論基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1研究材料

　　部分材料由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)余四斌教授、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李雙成教授和揚(yáng)州大學(xué)湯述翥教授饋贈。其中含29份三系野敗型雜交水稻的恢復(fù)系和86份微核心種質(zhì)構(gòu)成品種群體。4個(gè)兩系不育系[矮64S(PA64)、廣占63S(GZ63)、Y58S和新安S(AS)]及1個(gè)三系不育系[珞紅3A(3A)]構(gòu)成測交不育系。以上材料均為秈稻(詳見附表1)。根據(jù)這5個(gè)不育系(母本)和115個(gè)秈稻品種(父本)的SNP信息，進(jìn)而推算出測交群體F1代的SNP基因型用于后續(xù)分析。根據(jù)NCII遺傳交配設(shè)計(jì)，在海南陵水開展雜交試驗(yàn)，構(gòu)建測交群體。分別在2011年、2012年湖北鄂州、海南陵水兩地進(jìn)行雜交，獲得F1雜交種。115個(gè)父本與575個(gè)F1雜交子代于2013年種植在華中農(nóng)業(yè)水稻基地，田間種植1行10株，種植密度16.7cm×26.7cm，每點(diǎn)2次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)種植。

　　水稻成熟后于田間考察株高，收種時(shí)，從中間8株中選擇長勢均一的3株收種，室內(nèi)考察單株主穗實(shí)粒數(shù)(filledgrainsperpanicle，F(xiàn)GPP)、千粒重(1000-grainweight，KGW，g)、主穗長(mainpaniclelength，MPL，cm)、主穗一次枝梗數(shù)(primarybranchofmainpanicle，PBP)、株高(plantheight，PH，cm)、主穗二次枝梗數(shù)(secondarybranchofmainpanicle，SBP)、主穗穎花數(shù)(spikeletperpanicle，SPP)、有效穗數(shù)(effectivetillersperplant，TP)、單株實(shí)粒重(yield，YD，g)9個(gè)農(nóng)藝性狀。

　　1.2數(shù)據(jù)處理

　　為了深入了解水稻農(nóng)藝性狀的遺傳機(jī)制，把每個(gè)性狀對應(yīng)的數(shù)據(jù)集分成V、GCA、TC和BP4類。V代表親本(父本)的表型，GCA代表親本(父本)的一般配合力，TC代表測交群體的表型，BP代表測交群體的超親優(yōu)勢值，BP=F1−Pat，Pat表示父本的表型值。對這4類數(shù)據(jù)分別進(jìn)行GWAS分析。

　　1.3全基因組關(guān)聯(lián)分析

　　將收集到的水稻9個(gè)農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制，經(jīng)刪除maf<5>20%的SNP等一系列數(shù)據(jù)處理，得到1，894，012個(gè)SNP。以GAPIT軟件[14]的CMLM模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析處理。以P-value<10–4為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著性的SNP[15]，用于后續(xù)的分析。

　　1.4水稻基因注釋信息獲取

　　在國家水稻數(shù)據(jù)中心(http://www.ricedata.cn/，截至2018年10月15日)查找相關(guān)基因的注釋信息，利用python(version3.5.4)腳本實(shí)現(xiàn)多個(gè)檢索爬取結(jié)果于本地。

　　1.5通路分析

　　通過PlantGSEA(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PlantGSEA/index.php)，將爬取的結(jié)果用于分析。用PlantGSEA篩選出具有顯著性功能的通路[9]。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1PlantGSEA結(jié)果分析

　　針對9個(gè)農(nóng)藝性狀，在V、GCA、TC、BP四個(gè)數(shù)據(jù)集中分別共檢測到100、107、118、33個(gè)通路，其中有5個(gè)通路是4個(gè)數(shù)據(jù)集共有的，包括催化活性(GO:0003824)、陽離子結(jié)合(GO:0043169)、離子結(jié)合(GO:0043167)、代謝過程(GO:0008152)、初級代謝過程(GO:0044238)。對于這些通路，本研究將從9個(gè)農(nóng)藝性狀分別進(jìn)行詳盡的闡述。

　　2.1.1主穗實(shí)粒數(shù)

　　在V、GCA、TC數(shù)據(jù)集中與水稻主穗實(shí)粒數(shù)相關(guān)聯(lián)的通路數(shù)分別為1、37和4個(gè)。其中包括生物調(diào)控(GO:0065007)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)(GO:0010468)相關(guān)通路。在TC數(shù)據(jù)集中有flo-2基因。She等[16]研究表明flo-2通過影響胚乳中儲藏性物質(zhì)的積累，在調(diào)控水稻籽粒大小和淀粉品質(zhì)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果表明基因表達(dá)、生物調(diào)控過程都對主穗實(shí)粒數(shù)產(chǎn)生影響。

　　2.1.2千粒重

　　在V、GCA、TC數(shù)據(jù)集中與水稻千粒重相關(guān)聯(lián)的通路數(shù)分別為7、1和4個(gè)。其中包含半胱氨酸和蛋氨酸代謝(KEGG)相關(guān)通路。GCA、TC數(shù)據(jù)集中都含有GS3基因。Mao等[17]研究表明GS3是一個(gè)控制籽粒大小的主效QTL，它在調(diào)節(jié)籽粒和器官大小中具負(fù)調(diào)節(jié)子的功能。野生型等位基因包含N端的OSR結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜區(qū)，TNFR/NGFR家族富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，以及C端的VWFC4個(gè)推測的結(jié)構(gòu)域。C端TNFR/NGFR和VWFC結(jié)構(gòu)域顯示出對OSR功能的抑制作用，這2個(gè)功能域失活突變會產(chǎn)生非常短的籽粒。V、TC數(shù)據(jù)集中含有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(KEGG)通路和SaM基因。

　　3討論

　　對于農(nóng)藝性狀的研究，黃利興等[23]認(rèn)為單株有效穗、穗長、穗總粒數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重和著粒密度7個(gè)農(nóng)藝性狀親本的表現(xiàn)與一般配合力的效應(yīng)值呈顯著性正相關(guān)。廖伏明等[24]認(rèn)為一般配合力與親本自身的表型值有一定程度的正相關(guān)，說明在育種過程中必須注意親本自身農(nóng)藝性狀的改良。付新民等[12]的研究表明生育期、株高、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重性狀一般配合力與其表型值間的相關(guān)達(dá)到顯著或極顯著水平。說明這些性狀可以通過其表型選擇提高一般配合力。

　　同樣，我們的前期研究[8]表明除親本單株實(shí)粒重與一般配合力間相關(guān)性不顯著外，親本農(nóng)藝性狀與其一般配合力均為正相關(guān)。在本研究GCA與V中相同的通路有65個(gè)，除了生物生長所需的基本代謝通路DNA結(jié)合(GO:0003677)、蛋白質(zhì)代謝過程(GO:0019538)、離子結(jié)合(GO:0043167)等外，其中也包括一些影響相關(guān)性狀的通路，如半胱氨酸和蛋氨酸代謝(KEGG)、激酶活性(GO:0016301)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(KEGG)等。張遠(yuǎn)森[9]研究表明水稻粒重與細(xì)胞蛋白變性過程(GO:0006464)、激酶活性(GO:0016301)等通路相關(guān)。我們的結(jié)果與其部分相符。共同的通路在親本性狀和一般配合力中都起著一定的作用，表明性狀和一般配合力之間有著一定的相關(guān)性，這與前面學(xué)者研究得到的結(jié)果相符。

　　已知與性狀相關(guān)的代謝通路，那么該通路中的相關(guān)的節(jié)點(diǎn)基因可能對該性狀具有調(diào)控作用。而對于一般配合力的改良，我們可以通過找到影響相關(guān)性狀代謝通路的節(jié)點(diǎn)基因，改良相關(guān)性狀，以期改良一般配合力。在本研究的TC與BP中相同的通路有6個(gè)，包括催化活性(GO:0003824)、陽離子結(jié)合(GO:0043169)、離子結(jié)合(GO:0043167)、代謝過程(GO:0008152)、初級代謝過程(GO:0044238)、水解酶活性(GO:0016787)等。既然雜種數(shù)量性狀表型與雜種優(yōu)勢存在共同的通路，表明二者存在著一定的聯(lián)系。

　　而雜種優(yōu)勢的出現(xiàn)，可能是由于基因組合引起的。所以對于雜種優(yōu)勢的研究，我們可以從某一性狀的相關(guān)通路進(jìn)行，找到調(diào)控該通路的相關(guān)基因，以期改良該性狀，更好地挖掘雜種優(yōu)勢。這為揭示雜種優(yōu)勢的遺傳機(jī)理提供了一定的理論基礎(chǔ)。對于大部分?jǐn)?shù)量性狀，用于定位的表型數(shù)據(jù)直接來源于大田或溫室的測量值，或是對多年多點(diǎn)的數(shù)據(jù)測量值的線性估計(jì)，稱為構(gòu)成形狀。將表型值需要通過其他數(shù)量形狀測量值的代數(shù)運(yùn)算而獲得的性狀成為復(fù)合形狀[25]。一般配合力和超親優(yōu)勢值都屬于復(fù)合形狀。

　　水稻的長寬比(粒型)是一個(gè)重要的復(fù)合性狀，Li等[26]對一個(gè)大小為308的水稻BC3F1群體的粒長、粒寬和粒型進(jìn)行了QTL分析。在第3和第10染色體上發(fā)現(xiàn)2個(gè)控制粒長，第12條染色體上1個(gè)控制粒寬的QTL。2個(gè)控制粒型的QTL，其位置與控制粒長的2個(gè)QTL相近。而Rabiei等[27]對一個(gè)大小為192的水稻F2群體的粒長、粒寬和粒型進(jìn)行了QTL分析。在這18個(gè)QTL中，5個(gè)控制粒長，7個(gè)控制粒寬，6個(gè)控制粒型，其中有1個(gè)解釋15.0%表型變異的粒型QTL，既沒有被粒長發(fā)現(xiàn)，也沒有被粒寬發(fā)現(xiàn)。從Li等[26]和Rabiei等[27]對于水稻粒型的遺傳研究來看，復(fù)合性狀的QTL作圖和構(gòu)成性狀的QTL作圖會得到不同的結(jié)果，有時(shí)甚至出現(xiàn)一些復(fù)合性狀僅有的QTL。

　　在本研究中，表型性狀與一般配合力及超親優(yōu)勢值存在不同的通路，其之間的遺傳基礎(chǔ)應(yīng)該存在著差異。其遺傳機(jī)理是一個(gè)復(fù)雜的過程，到目前并沒有詳盡標(biāo)準(zhǔn)的參考，而本研究也為遺傳機(jī)理的解釋提供理論基礎(chǔ)，使水稻雜種優(yōu)勢以及一般配合力的遺傳機(jī)理得到更全面的揭示。本研究表明對于改良一般配合力和雜種優(yōu)勢，可以從水稻各性狀的代謝通路出發(fā)，找到該通路中的控制該性狀的相關(guān)基因，改良相關(guān)性狀、一般配合力和雜種優(yōu)勢。一個(gè)生物學(xué)過程是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，由基因組調(diào)控，并非單基因，本研究從基因集的水平出發(fā)，利用通路分析法對于雜種優(yōu)勢的獲得以及一般配合力的改良提出了新的思路。

　　4結(jié)論

　　基于通路分析的方法剖析水稻農(nóng)藝性狀配合力和雜種優(yōu)勢，4個(gè)數(shù)據(jù)集分別得到了100、107、118、33個(gè)與農(nóng)藝性狀相關(guān)的通路。對于改良一般配合力和雜種優(yōu)勢，可從基因集水平出發(fā)，找到通路中的控制該性狀的相關(guān)基因，以改良相關(guān)性狀、一般配合力和雜種優(yōu)勢。本研究結(jié)果可為后續(xù)解析水稻農(nóng)藝性狀一般配合力和雜種優(yōu)勢的遺傳機(jī)理提供重要的理論基礎(chǔ)。