摘要：已有研究證明乳酸菌具有緩解氧化應(yīng)激的作用。采用選擇性培養(yǎng)基從傳統(tǒng)自制的發(fā)酵食品中篩選得到34株乳酸菌，通過耐酸、耐膽鹽及耐H2O2試驗(yàn)從34株乳酸菌中篩選得到綜合耐受性較好的6株乳酸菌。比較這6株乳酸菌的菌體和無細(xì)胞提取物清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羥自由基、還原能力及抗脂質(zhì)過氧化等的體外抗氧化活性。

　　結(jié)果表明：6株乳酸菌中有4株體外抗氧化活性較好且其胞內(nèi)提取物的抗氧化活性均優(yōu)于菌體，其中以ZJ401的體外抗氧化活性最佳。利用API50CH分析和16SrDNA序列鑒定，確定ZJ401株乳酸菌為短乳桿菌Lactobacillusbrevis。ZJ401符合食品抗氧化發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)，對后續(xù)開發(fā)天然高抗氧化性發(fā)酵劑具有實(shí)際意義。

　　關(guān)鍵詞：乳酸菌;氧化應(yīng)激;菌種篩選;短乳桿菌

　　1956年英國學(xué)者Harmna首先提出了自由基衰老學(xué)說。自由基衰老理論(FRTA)認(rèn)為細(xì)胞的老化變化是由自由基反應(yīng)引起的[1]。1990年美國衰老研究權(quán)威Sohal教授指出了自由基衰老理論的缺陷[2]，并首次提出了氧化應(yīng)激的概念。氧化應(yīng)激即機(jī)體自由基生成增加或清除能力降低，引起機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的功能紊亂，導(dǎo)致自由基在體內(nèi)積累而引起的一系列氧化損傷過程[3]。

　　多種研究證明：氧化應(yīng)激不僅與衰老有著密不可分的關(guān)系，氧化應(yīng)激還與腫瘤的發(fā)生，哮喘、抑郁癥及各種慢性炎癥等疾病息息相關(guān)[4-6]。氧化應(yīng)激還參與心血管疾病的病理生理過程，引發(fā)動脈粥樣硬化、心力衰竭、高血壓和心肌損傷等[7]。機(jī)體自身的抗氧化能力有限，因此，通過攝入外源性的抗氧化劑已成為機(jī)體緩解氧化應(yīng)激的重要途徑。文獻(xiàn)報道具有抗氧化活性的微生物有乳酸菌、酵母菌，及某些致病菌，如炭疽病菌等[8]。

　　其中，乳酸菌是一種被人類廣泛利用的益生菌，常常被應(yīng)用在食品發(fā)酵工業(yè)及微生態(tài)制劑中。普通酸奶中僅添加保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌，而這兩種菌是“一過性”的保健菌，它們絕大多數(shù)不會進(jìn)入腸道，不能起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[9]。因此，現(xiàn)在越來越多的發(fā)酵乳中也開始添加除了保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌以外的益生菌。

　　目前，全球公認(rèn)的益生菌有雙歧桿菌、乳桿菌等。其中短乳桿菌是乳桿菌屬中的重要種群之一，其具有高產(chǎn)酸、去除亞硝酸鹽和產(chǎn)細(xì)菌素等功能[10]，尤其是短乳桿菌在發(fā)酵食品中去除亞硝酸鹽的作用顯著，具有用量小、作用快和使用方便等特點(diǎn)[11]。此外，Shakibaie等[12]發(fā)現(xiàn)一株富硒短乳桿菌，具有作為含硒添加劑的潛力。

　　益生菌類保健品在國外已經(jīng)發(fā)展了許多年，近幾年益生菌制品在國內(nèi)市場上逐漸得到認(rèn)可。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌能夠清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，羥自由基等活性氧自由基，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激[13-14]。乳酸菌作為天然食品添加劑能緩解機(jī)體氧化應(yīng)激以及一些疾病的發(fā)生。因此，篩選具有較好緩解氧化應(yīng)激功能的乳酸菌具有重要研究意義及應(yīng)用前景。本研究通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)自制的發(fā)酵食品中篩選出具有緩解氧化應(yīng)激功能的益生菌菌株，以期為開發(fā)具有緩解氧化應(yīng)激功能的乳酸菌食品發(fā)酵劑奠定理論基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1材料與儀器

　　傳統(tǒng)自制的發(fā)酵蔬菜：蘿卜、白菜、長豇豆和芥菜;嬰兒糞便，采集于25d健康嬰兒;MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏10.0g/L，檸檬酸二銨2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，硫酸鎂0.58g/L，硫酸錳0.25g/L，磷酸氫二銨2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫-801mL;二苯基苦基苯肼自由基(Sigma生物試劑有限公司);DNA抽提試劑盒，由生工生物工程(上海)股份有限公司出品;API50試劑條(生物梅里埃中國有限公司);鄰菲羅琳、過氧化氫、硫酸亞鐵和抗壞血酸等試劑(均為國產(chǎn)分析純)。

　　生化培養(yǎng)箱(型號SPX-250B-Z，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);紫外/可見分光光度計(jì)(型號UV1000，上海天美科學(xué)儀器有限公司);超聲波破碎儀(SON-ICS，型號VCX500);臺式高速冷凍離心機(jī)(Ther-mo，型號Stratos);聚合酶反應(yīng)儀(Eppendorf，型號Mastercycler)。

　　1.2實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1樣品的采集

　　使用一次性無菌注射器采集發(fā)酵蔬菜的湯汁，保存于已滅菌的EP管中。對嬰兒糞便進(jìn)行無菌采集，采樣后樣品封口膜封口，均保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.2乳酸菌的分離純化

　　將樣品用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的樣品均勻涂布于pH為5.0的MRS固體培養(yǎng)基上，放入37℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h。觀察菌落形態(tài)，挑選符合乳酸菌形態(tài)的菌落進(jìn)行3次劃線純化。對純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶實(shí)驗(yàn)。革蘭氏染色陽性，接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰性的菌株可初步判定為乳酸菌。

　　1.2.3乳酸菌耐受性實(shí)驗(yàn)

　　1)乳酸菌的耐酸性測定：將活化后的菌株，以3%的接種量分別接種于pH為2.0，3.0，4.0，6.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h。16h后測其在600nm處的吸光值。2)乳酸菌的膽鹽耐受能力測定：將活化的菌株，以3%的接種量接種于分別含有0，0.3%，0.5%豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h。16h后測其在600nm處的吸光值。3)乳酸菌的過氧化氫耐受能力測定：將活化的菌株按3%接種于過氧化氫濃度分別為0.4，0.7，1.0mmol/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h。16h后測其在600nm處的吸光值。

　　1.2.4乳酸菌體外抗氧化能力測定

　　1)樣品的處理樣品處理參考Lin等[15]的方法。完整細(xì)胞懸液：將菌以1%接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h后4℃，4000r/min離心10min，棄上清，收集菌體，收集的菌體經(jīng)PBS(pH為7.2)洗滌3次，再懸浮于PBS中，調(diào)整菌數(shù)至1×109cfu/mL。胞內(nèi)提取物：將上述菌數(shù)為1×109cfu/mL的完整細(xì)胞懸液激進(jìn)行超聲破碎，功率400W，工作5s，停5s，60次。破碎后將懸液4℃，10000r/min離心10min，收集上清。

　　1.2.5菌種鑒定

　　1)16SrDNA：將乳酸菌ZJ401過夜培養(yǎng)后，取適量菌液利用試劑盒提取全基因組。得到的全基因組用16S通用引物進(jìn)行PCR(27F：5'-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3';1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，將PCR產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對。

　　2)API50CH菌種鑒定：用API50CH及API50CHL進(jìn)行乳酸菌的生理生化鑒定，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

　　3)生長曲線分析：取50mL已發(fā)酵24h的菌液離心棄上清，用生理鹽水洗滌后再離心棄上清，置于烘箱中烘干至恒重(65℃，24h)，測其干重，以此為依據(jù)分別計(jì)算出1，2，4，5，6，8，10mL發(fā)酵液的菌體干重。另取1，2，4，5，6，8，10mL菌液，離心棄上清后用生理鹽水重懸浮混勻定容至25mL，分別測其OD600nm，得到吸光值OD600nm與菌體干重的生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線。另以1%的接種量將乳酸菌ZJ401接種于MRS液體培養(yǎng)基中，每隔2h取一定量菌液進(jìn)行OD600nm測定和pH測定。

　　1.2.6統(tǒng)計(jì)分析

　　每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS19.0的單因素方差分析顯著性差異。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1乳酸菌的分離純化

　　從10種不同來源的樣品中分離得到34株菌，革蘭氏染色均為陽性，接觸酶實(shí)驗(yàn)均為陰性。因此初步鑒定這34株菌為乳酸菌，菌落形態(tài)為乳白色，表面光滑，邊緣整齊的圓形菌落，鏡檢下可看到這34株菌為長桿狀或短桿狀。

　　2.2乳酸菌耐受性

　　2.2.1乳酸菌的耐酸性

　　乳酸菌需要有較好的耐酸性才能在胃酸環(huán)境下維持活性，對34株菌進(jìn)行了耐酸性試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其中有6株乳酸菌的耐酸性較好，小寫字母a～f表示同一菌株在不同pH條件下的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。

　　當(dāng)pH為6，7時，乳酸菌的OD600nm最高活性最好，說明pH在6.0到7.0左右是這幾株菌的最佳培養(yǎng)條件。6株菌均能在pH為4.0的壞境下生長，其中ZJ906的活性最差。

　　當(dāng)pH為3.0時，只有ZJ401還具有活性，其余5株菌均無法生長。當(dāng)環(huán)境pH為2.0時，所有菌株的生長水平與初始一致，所有菌株均無法生長。正常人體的胃液pH最低可達(dá)2以下，人體消化不同食物的時間在30min到4h不等。因此在pH越低的環(huán)境下具有耐受性的乳酸菌越能在胃酸中維持活性，到達(dá)腸道。由上可看出ZJ401具有較好的耐酸性。

　　2.2.2乳酸菌的膽鹽耐受性

　　乳酸菌要順利到達(dá)腸道，除了需要具有一定的耐酸能力以外，還需要具有一定的膽鹽耐受能力，正常人體腸道中膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%波動，乳酸菌在此膽鹽濃度下具有活性就有可能在腸道中定植。小寫字母a～d表示同一菌株在不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。膽鹽對這6株乳酸菌活性影響均較大，但這幾株乳酸菌在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的培養(yǎng)條件下都具有活性，說明這幾株乳酸菌對膽鹽有一定耐受能力。

　　2.2.3乳酸菌的H2O2耐受能力

　　H2O2是一種弱氧化劑，會引起人體的氧化損傷。乳酸菌對H2O2的耐受性是篩選緩解氧化應(yīng)激乳酸菌的重要指標(biāo)之一。6株乳酸菌在不同H2O2濃度下的生長情況。可看出：隨著過氧化氫濃度的升高，對除ZJ803以外的菌株生長有一定的影響。但是菌株的存活率均較高，因此這6株乳酸菌對過濃度為1mmol/L的過氧化氫都具有耐受性。

　　2.3乳酸菌體外抗氧化能力

　　2.3.1DPPH清除率

　　DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除實(shí)驗(yàn)常用于抗氧化能力的評價實(shí)驗(yàn)中。當(dāng)自由基清除劑存在時，DPPH自由基接受一個電子或氫原子，形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，使其乙醇溶液從深紫色變?yōu)辄S色，變色程度與其接受的電子數(shù)量(自由基清除活性)成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析[21]。

　　對6株乳酸菌進(jìn)行DPPH清除率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中ZJ302，ZJ804的DPPH清除率均低于5%，其余4株菌DPPH清除率均在10%之上，小寫字母a～c表示同一種狀態(tài)下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。

　　DPPH清除率最高的兩株菌是ZJ401，ZJ803，且發(fā)現(xiàn)4株乳酸菌的無細(xì)胞提取物的DPPH清除率均略高于完整菌體，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZJ803的DPPH清除率實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。

　　2.3.2羥自由基清除能力

　　芬頓反應(yīng)是過氧化氫和二價鐵離子催化反應(yīng)生成具有強(qiáng)氧化能力的羥基自由基，目前芬頓反正也廣泛應(yīng)用于抗氧化能力的評價實(shí)驗(yàn)中，小寫字母a～d表示同一種狀態(tài)下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。4株菌中ZJ401的羥自由基清除能力最好，其次是ZJ803，ZJ312，羥自由基清除能力最差的是ZJ906。與DPPH清除率實(shí)驗(yàn)相同，4株菌的無細(xì)胞提取物的羥自由基清除能力均高于完整菌體。

　　2.4菌種鑒定

　　2.4.116SrDNAZJ401的16srDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

　　擴(kuò)增條帶單一，且擴(kuò)增片段大小在1500bp左右。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至公司進(jìn)行雙向測序，拼接后的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對。結(jié)果顯示與ZJ401序列同源性最高的菌株為短乳桿菌(相似度99%，序列號NR116238.1)。選取同源性高的典型菌種序列，對ZJ401與其發(fā)育關(guān)系相近的菌株進(jìn)行遺傳距離計(jì)算。應(yīng)用MAGE5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

　　3結(jié)論

　　隨著科技進(jìn)步和生活水平的提高，細(xì)胞抗氧化與抗衰老越來越多地為人們所關(guān)注。細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷與衰老及多種疾病都有著密不可分的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)從各種發(fā)酵食品中篩選得到34株乳酸菌，經(jīng)耐酸耐膽鹽及耐過氧化氫實(shí)驗(yàn)得到6株耐受性較好的乳酸菌，通過DPPH清除率，羥自由清除率，還原活性，抗脂質(zhì)過氧化率實(shí)驗(yàn)對菌株的體外抗氧化性進(jìn)行了鑒定，確定了一株具有優(yōu)良抗氧化性的短乳桿菌，命名為ZJ401。ZJ401具備優(yōu)良的體外抗氧化活性和益生性能，為后續(xù)乳酸菌的菌種選育，食品發(fā)酵工業(yè)中功能性抗氧化食品發(fā)酵劑的研制，以及新型的益生活菌制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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