摘要：采用組織分離法從黃皮疣柄牛肝菌、小美牛肝菌、雙色牛肝菌的子實體中，分離純化獲得株內生真菌，經菌落、菌絲、孢子形態學觀察及rDNAITS分子生物學鑒定，結果顯示：菌株LCTG12為蓋姆斯木霉Trichodermagamsii、LCCK為克魯伊假絲酵母Candidakruisii、BSHC18為黃瘤孢菌Hypomyceschrysospermus、BBFO10為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysprum。對株內生真菌生物學特性進行研究，其中蓋姆斯木霉菌絲生長速度較快，在CPDA培養基上，25℃培養5d菌絲長滿平板;液態培養時，該菌株在25℃、搖床轉速160r/min、pH5.5、8d，可獲得菌絲干基生物量4.13g/L。平板對峙實驗結果：蓋姆斯木霉LCTG12對黃瘤孢菌BSHC18和尖孢鐮刀菌BBFO10菌絲生長均有拮抗作用，并且，黃瘤孢菌BSHC18和尖孢鐮刀菌BBFO10兩者之間也具有拮抗作用，表明牛肝菌內生真菌中蓋姆斯木霉對腐敗菌具有拮抗作用，可為生物防腐提供優良的菌株。

　　關鍵詞：野生牛肝菌，組織分離法，內生真菌，ITS分子鑒定

　　牛肝菌(Boletaceae是真菌界(Fungi)，擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricates)的大型真菌[1]，我國已知牛肝菌科有28屬，397種及變種[2]，主要產地在云南。牛肝菌是一個復雜的生命體，其整個生命周期都伴隨著內生真菌，內生菌之間可通過相互作用共同促進宿主的生長發育，也可與大型真菌的協同作用促進宿主產生更多的次生代謝產物。

　　生物真菌論文范例：構樹葉投喂草魚腸道真菌群落多樣性研究

　　內生真菌(Endophyticfungi)定殖于健康的生物組織內部[3]，是構成菌物生態系統的天然組分。目前，具有抑菌、抗癌等活性的大量次生代謝產物從內生真菌中分離出來[47]，內生真菌將成為開發生物活性物質的資源寶庫[8]。野生牛肝菌是優良的外生菌根真菌，其生長對寄主要求嚴格，大多數種類仍不能通過人工栽培形成子實體[910]，在野生牛肝菌子實體獲得母種菌絲的分離過程中，研究明確與其內生真菌的關系，是獲得原種、栽培種的基礎，也是獲得新的真菌資源途徑之一。牛肝菌子實體含有大量人體必需氨基酸、礦物質、以及多種生物活性成分[1112]，具有降血脂、抗氧化、護肝、抗腫瘤、降血糖、清熱解煩等功能[1317]。對于牛肝菌的研究主要集中在化學成分、生物活性等方面[1819]，而對于牛肝菌內生真菌的報道較少，丁小維等[20]從牛肝菌子實體中分離出毛霉屬Mucorsp.)和黃瘤孢菌Hypomyceschrysospermus株內生真菌，并發現株內生真菌的發酵液都能抑制豆芽的生長。岳萬松等[21]從種牛肝菌子實體中分離出株內生真菌，分別為毛栓菌Trameteshitsuta、假絲酵母屬Candidasp.)、被孢霉屬Mortierellasp.)、散囊菌屬Eurotiumsp.)、金色毛殼菌Chaetomiumaureum。組織分離法是分離內生真菌的重要方法之一，本研究通過組織分離法從種新鮮野生牛肝菌中分離獲得株內生真菌，結合菌株的形態特征和rDNAITS序列分析，對菌株進行鑒定，構建出系統發育樹，并對幾種內生真菌生長規律及內生真菌之間的拮抗關系等生物學特性進行研究，旨在為深入研究野生牛肝菌與內生真菌之間的關系進行初步探究，并為牛肝菌生長過程及采摘后的生物防腐提供優良的生防菌株，也可為開發新資源化合物提供菌種資源[2224]。

　　1材料與方法

　　1.1材料與儀器

　　鮮野生牛肝菌子實體：黃皮疣柄牛肝菌Leccinumcrocipodium(Letellier)watl.)、小美牛肝菌BoletusspeciosusFrost)、雙色牛肝菌BoletusbicolorPeck)分別采摘于云南省楚雄彝族自治區祿豐縣和南華縣，無菌袋、冰袋封裝，空運24h內分離。GK2043(膠回收試劑盒)GK1071(DNA提取試劑盒)引物ITS1和ITS4上海捷瑞生物工程有限公司合成。

　　固體培養基CPDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KHPO43g，MgSO·7HO1.5g，VB1mg，蛋白胨0.5，瓊脂20g，水，pH自然(液態培養基去掉瓊脂);固體培養基Pachlewski：葡萄糖20g，酒石酸銨0.5，KHPO41g，MgSO·7HO0.5g，VB0.1mg，瓊脂20g，mL/L微量元素混合液(BO8.45mg，MnSO5mg，FeSOmg，CuSO0.625mg，ZnCl2.77mg，(NHMoO0.27mg)，去離子水1L;固體培養基MMN：NaCl0.025g，葡萄糖10g，KHPO40.5g，麥芽浸粉3.0g，VB0.1mg，CaCl0.05g，(NHHPO40.25g，瓊脂20g，FeCl0.012g，MgSO·7HO0.15g;75%乙醇;JY300C電泳儀北京君意電泳設備有限公司;JY02G凝膠成像系統北京君意電泳設備有限公司;BeckmanJT25R高速冷凍離心機美國貝克曼庫爾特有限公司;ABI3730測序儀北京東迅天地醫療儀器有限公司。

　　1.2實驗方法

　　1.2.1野生牛肝菌內生真菌分離與純化

　　將新鮮野生牛肝菌子實體用自來水沖洗數次，去除表面雜質，無菌水沖洗遍，75%乙醇漂洗2min，再用無菌水沖洗次，無菌紗布擦干子實體表面。采用組織分離法進行以下操作，用無菌解剖刀將牛肝菌子實體縱切開后，將內部的組織切割成0.5cm左右的小塊，接種于CPDA培養基中，25℃恒溫避光培養5d。待小塊組織周圍有內生真菌菌絲長出后，挑取少許菌絲，采用點植法純化培養，轉接次。共獲得23株純菌株，并移接至斜面試管4℃保存。

　　1.2.2野生牛肝菌內生真菌形態學鑒定

　　將23株真菌分別點植固體平板培養，挑選出形態、顏色有明顯差異的菌落株，分別接種到CPDA固體平板上，25℃避光培養5d，觀察菌落形態，顯微鏡觀察菌絲及分生孢子顏色、形態，以十字交叉法記錄菌落直徑，且移接至斜面試管，待培養長出菌絲體后，4℃保存。

　　1.2.3基于rDNAITS序列分析的內生真菌分子鑒定

　　采用GK1071提取試劑盒，對株純化菌株進行DNA提取。使用真菌ITS鑒定通用引物：ITS1：’TCCGTAGGTGAACCTGCGG’和ITS4：’TCCTCCGCTTATTGATATGC’對DNA的ITS片段進行PCR擴增。擴增體系為30µL反應體系，包括：10TaqBuffer3µL，dNTP1µL，Taq酶1µL，上游引物(10µmol/L)和下游引物(10µmol/L)各1µL，DNA模板2µL，ddH補足至30µL。

　　反應條件：預變性95℃，5min，95℃，15s，95℃，15s，95℃，45s，35個循環，72℃，5min保存。PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳體系檢測，采用凝膠成像系統觀察結果。PCR擴增產物用膠回收試劑盒GK2043回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司進行測序。將株內生真菌所測序列在GenBank中進行BLAST對比，選擇同源性高于95%的序列，運用MEGA軟件進行多重比較，通過NJ法構建系統發育樹，并以bootstrap對發育樹進行自舉法檢驗1000次，從而確定菌株的親緣關系及分類地位。

　　1.2.4液態發酵及干基生物量的測定

　　接種1cm菌絲塊于裝液量為80mL的250mL三角瓶中，在25℃，搖床轉速160r/min，分別稱量10d的生物量干重，每組設置個重復，將發酵液在5000r/min離心10min，收集菌絲體移至干燥皿中，置于70℃烘箱中，每隔1h取出稱量，直到重量不再改變，即為生物量干重。

　　2結果與分析

　　2.1菌株的形態特征

　　從云南省個地區采摘的個種的野生牛肝菌子實體，共分離出可培養的內生真菌23株，通過菌落形態初步判斷多數為木霉屬，從中篩選出具有菌落形態、顏色、氣味等差異大的株菌種，接種于CPDA培養基上，在25℃下培養5d，平板生長的菌落形態、光學顯微鏡觀察的菌絲、孢子形態，利用MoticImagesPlus2.0軟件進行顯微形態(10×100)拍攝。

　　2.24種內生真菌菌株的系統發育樹構建及分析

　　利用ITS通用引物(ITS1、ITS4)對株內生真菌進行序列擴增得到條基因序列，序列長度分別是LCTG12為620bp;LCCK為421bp;BSHC18為606bp;BBFO10為550bp。將以上條序列分別在NCBI庫中進行在線BLAST比對，每種菌下載條同源性高于95%的序列，以測序得到的基因序列為基礎，同公共數據庫下載的相似序列合并，采用MEGA軟件，按照neighborjoiningmethod(法)，經過自舉法1000次進行檢驗構建系統發育樹，以此對菌株進行種水平的分類鑒別。

　　株菌在NCBI中LAST比對結果顯示：在100條序列比對結果中，LCTG12與76株木霉屬序列Trichodermasp.)的序列同源性為99%以上，說明該菌為木霉屬;LCCK與55株念珠菌屬Candida的序列同源性為90%以上說明該菌為念珠菌屬;BSHC18與50株菌寄生屬Hypomycessp.)的序列同源性為90%以上說明該菌為菌寄生屬;BBFO10與94株Fusariumoxysprum的序列同源性為99%以上。系統發育樹樹枝的長短表示各菌株之間的遺傳距離，同一支說明親緣關系很近，以系統發育方法可以對關系較為密切的菌株序列進行較好的判別。

　　結合形態學鑒定及BLAST對比及系統發育樹結果：LCTG12與NCBI數據庫中的Trichodermagamsii聚類在同一支上，自檢支持率100%，鑒定該菌為蓋姆斯木霉;LCCK與Candidakruisii聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為克魯伊假絲酵母;BSHC18與Hypomyceschrysospermus聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為黃瘤孢菌;BBFO10與Fusariumoxyspru聚類于同一株上，自檢支持率達100%，鑒定該菌為尖孢鐮刀菌。

　　2.3野生牛肝菌內生真菌的生物學特性

　　2.3.1種培養基對內生真菌生長速度的影響為掌握株內生真菌(LCTG12、LCCK、BSHC18、BBFO10)的生物學特性，選擇CPDA、Pachlewski、MMN為供試培養基，研究種培養基對菌絲生長速度的影響，25℃培養，在cm的平板上采用十字交叉法測量菌落直徑，結果如圖所示。由圖可知，在培養第4d時進行菌落直徑測量，PDA上的生長速度明顯優于其他種培養基，內生真菌LCTG12培養5d，LCCK培養6d，BSHC18培養7d，BBFO10培養8d可長滿平板，故選擇CPDA培養基為種內生真菌的最適培養基。

　　結論

　　目前對于牛肝菌中的內生真菌報道較少，為探究野生牛肝菌中內生真菌資源，及分析其內生真菌間是否存在拮抗關系，本文以種新鮮野生牛肝菌子實體為分離材料，經過組織分離純化共得到23株純菌株，從中篩選出株具有典型特征的純菌進行形態觀察和ITSrDNA現代分子生物學鑒定，鑒定出內生真菌LCTG12為蓋姆斯木霉Trichodermagamsii;LCCK為克魯伊假絲酵母Candidakruisii;BSHC18為黃瘤孢菌Hypomyceschrysospermus;BBFO10為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysprum，并對幾種內生真菌生長規律及內生真菌之間的拮抗關系等生物學特性進行研究。

　　得出結論：CPDA培養基較適合這株菌的生長，其中蓋姆斯木霉的生長速度較快，5d即可長滿9cm的平板，其余種菌株長滿板的時間分別為6、7d、8d，并且蓋姆斯木霉對黃瘤孢菌和尖孢鐮刀菌菌絲生長均有拮抗作用，黃瘤孢菌和尖孢鐮刀菌兩者之間也具有拮抗作用。

　　牛肝菌等大型真菌生長過程中會出現腐敗菌導致其菇體腐爛和根腐病[2628]，且內生真菌的次級代謝產物豐富[290]，故進一步研究其內生真菌能夠產生結構新穎、活性廣泛的次級代謝產物對新型藥用資源開發具有重要的意義。本文旨在為深入研究野生牛肝菌與內生真菌之間的關系進行初步探究，并為牛肝菌生長過程中可能出現的病害及采摘后的的生物防腐提供優良的生防菌株。

　　參考文獻：

　　[1]卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學技術出版社,2000:315.MaoXL.Chinesemacrofungi[M].Zhengzhou:HenanScienceandTechnologyPress,2000:315.

　　[2]李泰輝宋斌中國牛肝菌已知種類[J].貴州科學2003,31):7886.LiTH,SongB.oletespeciesknownfromChina[J].GuizhouScience,2003,31):7886.

　　[3]PetriniO.Fungalendophytesoftreeleaves[C]//AndrewsJH,HiranoSS,eds.Microbialecologyofleaves.NewYork:SpringerVerlag,1991:179197.

　　作者：徐偉，張雪，王植朔，謝紅瑤，吳凡，邵百琪