摘要定量工程生物學是一門前沿交叉學科,通過設計-合成-測試-學習-再設計路線將不同的生物元器件組合,形成可以執行特定功能的基因線路,再經過不斷優化獲得穩定的、可控的基因線路,最后將設計優化后的線路引入不同的生命體,以達到預設的目的.這種變革性的方法可以創建一些能夠靈敏感知和響應各種環境的工程系統,但在其中的功能檢測環節,化學蛋白質組學技術則成為了測試工程改造生物功能和探究其作用機制的重要工具.隨著以非天然氨基酸嵌入、生物正交化學、高分辨率質譜等技術為手段的化學蛋白質組學方法的發展,在復雜環境中解析工程生物的蛋白質組時空動力學變化成為可能,為探究工程改造菌或工程改造細胞的工作原理及其在生物體內的作用機制提供了必要的技術支撐,也為定量工程生物學研究中所需的深度功能測試提供了有效方法.本文主要是概述化學蛋白質組學技術在定量工程生物學研究中的潛在應用.

　　關鍵詞定量工程生物學,基因線路,化學蛋白質組學,生物正交化學

　　自20世紀末以來,生命科學發生著日新月異的變化.生命科學也逐步由定性、局部性的研究向定量、系統化、工程化的方向發展,定量工程生物學(quantitativeengineeringbiology:即通過理性設計和精準地導入人工系統來定量地認知生命機制,踐行“造物致知”[1])應運而生.定量工程生物學基于對現有生命系統或各種元器件功能的認識,按照工程化的設計原理對生命系統進行簡化處理,以最優化的方式重新編程,構建出多種優化的基因線路,使其發揮預先設定的功能.例如,生產新型生物能源和生物材料、合成多種臨床藥物以及特異性殺傷腫瘤細胞等.另一方面,工程生物學以超越自然進化法則的方式對天然的生物系統進行人工干擾、重建甚至創造新的生命體,并以此研究復雜生物系統的運行規律以及生物進化的歷程.定量工程生物學在臨床疾病治療、化工生產等領域的廣泛應用彰顯出其強大的適應性.

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　　但有一個問題不容忽視,即將設計、優化后的基因線路放在底盤細胞中,對細胞自身的正常生長以及細胞所處微環境是否有影響,有哪些影響?工程改造的細胞能否像天然細胞一樣,在其所處的微環境中正常生長,擁有正常的細胞通訊功能,還有待進一步驗證.蛋白質是生物功能的執行者,生物體內蛋白質處 于動態變化的狀態,生物體通過調控蛋白質的合成和降解的速率以及翻譯后修飾來適應其體內外環境的變化.因此想要對生命的復雜活動有全面而深入的認識,必然要在整體、動態網絡的水平上對蛋白質進行研究.近些年來,隨著化學蛋白質組學的發展,高分辨率質譜技術的進步以及計算機算法的革新,使得我們能夠以高通量水平從復雜的生物樣品中鑒定和定量數千種蛋白質,獲取生物體蛋白質組的動力學信息,進而得以解析各種生命活動的生物學機制,能夠更加深入地理解生命體,為定量工程生物學研究中所需的深度功能測試提供了強有力的技術支撐.

　　1工程生物的蛋白質組時空動力學

　　隨著工程生物學的快速發展,諸多人工改造的工程生物面世.這些工程生物有些可以為人類生產復雜的有機分子,有些則有助于人們對于生命奧秘的探索.以酵母細胞作為底盤細胞的研究為例.2003年,Keasling實驗室[2]將帶有10個酶的合成通路裝載到大腸桿菌中,實現了青蒿酸(青蒿素的前體)的合成.隨后他們又將該合成途徑優化后引入到發酵效率更高的酵母體系中,實現在酵母菌中生產抗瘧疾藥物青蒿素,并于2013年實現了量產[3].斯坦福大學的Smolke團隊[4]將合成阿片類藥物的5個基因導入酵母基因組,實現在酵母細胞中生產阿片類藥物.2018年,中國科學院上海植物生理生態研究所的覃重軍課題組與紐約大學的Boeke團隊[5,6]發表了關于酵母染色體融合重塑基因組結構的研究成果,分別將釀酒酵母的16條染色體融合為1和2條染色體.研究表明,重塑基因組結構的酵母細胞與野生型酵母具有相似的轉錄組水平及表型.

　　2019年,Keasling團隊[7]將大麻中的相關基因插入啤酒酵母,使得酵母能夠利用半乳糖合成四氫大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD),實現在酵母中生產“大麻啤酒”,該研究有望幫助生物制藥公司以較低的成本、批量生產大麻中的各種化學成分.雖然近20年工程生物學的研究與應用已經取得了令人矚目的成果,但是我們對于工程生物本身還知之甚少,這嚴重影響著對工程生物的廣泛開發及其工業化應用.目前關于工程微生物的研究主要局限于通過觀察表型或者轉錄組分析,而蛋白質是生物功能的執行者,因此基因組、轉錄組信息不能準確展現工程生命體的信息,并且生物體內蛋白質合成和降解處于動態變化的狀態,當機體處于應激條件下或者其所處的內外環境發生變化時,蛋白質組會發生瞬時變化,既有大量新合成的蛋白質,又有一些蛋白質會發生快速降解.因此我們可以利用化學蛋白質組學技術研究工程生物的蛋白質動力學,加深對工程生物的認識.

　　下面將從3個層面闡述用于研究蛋白質組動力學的化學蛋白質組學技術.1.1定性鑒定新合成的蛋白質組非天然氨基酸嵌入技術最早由Schultz團隊[8]提出,已有30多年的歷史.隨后,以Schultz實驗室為代表的多個團隊創建了原核及真核生物遺傳密碼子擴增的方法學[9~12],將帶有多種不同報告集團(如熒光素、光交聯基團、細胞毒素等)的非天然氨基酸位點特異性地嵌入新合成的蛋白質[13~15].2006年,Dieterich等人[16]提出生物正交非天然氨基酸標記(bio-orthogonalnoncanonicalaminoacidtagging,BONCAT)策略,用于親和富集、鑒定細胞中新合成的蛋白質[17,18].利用細胞內源性翻譯機制,將帶有生物正交基團的非天然氨基酸嵌入到新合成的蛋白質中[19],生物正交基團作為代謝標簽對蛋白質進行化學標記,將新合成的蛋白與預先存在的蛋白區分開來,從而降低了樣品的復雜度[16,20].

　　在蛋白質合成過程中,位點特異性地向蛋白質中加入帶有化學探針的非天然氨基酸[21],賦予被標記的蛋白獨特化學功能.隨后利用生物正交基團的特性,通過Cu催化[3+2]疊氮-炔基環加成反應[22,23]對新合成的蛋白質進行選擇性分離純化、富集,或者通過熒光成像等手段觀察蛋白質的動態變化[17,18].BONCAT不僅可以用作狹義蛋白質組學(即基于質譜分析的蛋白質組研究)的研究工具,也可以用作廣義蛋白質組學研究(例如基于熒光成像[24]的新生蛋白質組學研究等)的技術手段.類似的概念近年來也被推廣到核酸[25,26]、糖類[27]和脂類[28]的代謝標記等領域中,用于對這些物質進行富集分析、動力學變化檢測或高靈敏度示蹤.研究證明,BONCAT技術廣泛適用于追蹤各種模型系統中新合成的蛋白質,例如細菌[29]、哺乳動物細胞[30,31]和斑馬魚等動物模型[32].

　　可用于檢測蛋白質組的動態變化[33]、核糖體的轉換率[34]以及在活體中原位、可視化監測大鼠海馬區神經元中新合成蛋白的動力學變化等[30,35],研究當多巴胺能神經元受到化學刺激時,軸突是怎樣做出應激反應以維持自身穩定[36].Schuman團隊[32]在活體斑馬魚模型中已成功運用BONCAT技術,實現對復雜神經系統中的新合成的蛋白質進行可視化觀察和親和純化分析,證明長期記憶的形成過程會伴隨大量新的蛋白質合成.Tcherkezian等人[30]觀察到結直腸癌缺失基因受體(deletedincolorectalcarcinoma,DCC)與蛋白質合成位點的共定位,為紡錘體蛋白作為刺激神經元中核外蛋白質產生的作用提供了支持.

　　1.2定量分析新合成的蛋白質組

　　為了克服BONCAT時間分辨率不足,以及不能對蛋白質組進行定量分析的技術限制,Acuto團隊將BONCAT技術[16]與SILAC(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture,即在細胞培養的過程中,在培養基中加入穩定同位素標記的氨基酸,經過細胞代謝過程,使得蛋白帶上同位素標簽)技術[37]聯用,將它們的優勢結合在一起形成定量非天然氨基酸標記策略(quantitativenoncanonicalaminoacidtagging,QuaNCAT)[38].Bagert等人[39]在HeLa細胞中聯合使用BONCAT和pSILAC技術(pulsedSILAC,是指在較短的時間段內(從5min到若干小時)對蛋白質進行脈沖式的SILAC標記),在30min的脈沖標記的時間區間內,成功鑒定到1484種新合成的蛋白.

　　這是單獨使用同位素標記技術無法達到的時間分辨率.Howden等人[38]利用QuaNCAT技術檢測當原代T細胞經過佛波酯和離子霉素共刺激后,T細胞蛋白質表達組的變化.BONCAT技術與SILAC技術聯用,通過將新生蛋白親和純化標簽與蛋白質譜定量標簽兩種代謝插入相結合,有助于評估細胞蛋白表達量的短時應激變化,具有更高的定量準確度和檢測靈敏度.克服了BONCAT技術定量鑒定的準確性較低,以及SILAC技術標記時間長且僅適用于研究穩態蛋白質組的變化的缺陷.QuaNCAT技術不需要對細胞或生物體進行饑餓處理,減少了對樣品造成的干擾,因而所測得的數據能更好地反映真實的生理條件下蛋白質的動態變化情況.

　　2復雜環境中解析工程生物的蛋白質組

　　近年來,工程生物學在臨床疾病治療領域應用越來越廣泛,在腫瘤、代謝病、重大傳染病等方面已經取得了引人注目的研究成果,并有望解決目前臨床面臨的諸多難題.通過工程生物學改造的細菌可以提高其靶向腫瘤、有效荷載外源基因的能力,使腫瘤的細菌療法煥發生機.例如,在細菌體內安裝群體感應(quorumsensing,QS)開關調控的基因線路,只有當細菌種群達到閾值密度時才能激活效應基因的表達,該線路能夠有效提高細菌靶向腫瘤細胞的特異性[50~52].

　　對于工程改造的沙門氏菌,利用其T3SS分泌系統向腫瘤細胞遞送抗血管生成蛋白,可有效抑制體內腫瘤的生長[53,54],或者將工程菌上的腫瘤相關抗原傳遞給抗原呈遞細胞,激活免疫細胞從而引發抗腫瘤免疫[55].2019年,哥倫比亞大學TalDanino課題組[56]對大腸桿菌進行改造,作為遞送免疫治療藥物的載體,協助免疫系統從內部攻破腫瘤.相較于腫瘤的細菌治療,溶瘤病毒(oncolyticvirus,OVs)在臨床應用上已經先行一步,它們具有裂解腫瘤特異性細胞和激活免疫反應的能力,可作為潛在的原位腫瘤疫苗.

　　3前景與展望

　　近些年來,定量蛋白質組學研究技術的發展,使得研究人員能夠以前所未有的時間和空間分辨率監測蛋白質合成,研究內在外環境發生變化時,生物體在極短時間內的應激反應.利用現有的化學蛋白質組學技術獲取生物體的蛋白質組動態變化的信息,進而深入探究各種生理病理現象的生物學機制,推動定量工程生物學的發展.

　　促進藥物研發、早期臨床診斷,成為臨床疾病診斷及治療的強有力輔助工具.蛋白質組學的研究技術目前還存在諸多不完善之處,新型定量蛋白質組學技術正處于研發階段,期待在不久的將來,技術的發展可以實現在單細胞水平上監測生物體的生理和病理狀態及其蛋白質組的動態變化;以利于篩選疾病的生物標記物,獲取特定細胞的分泌組,用于疾病的早期臨床診斷;為研究定量工程生物學中新改造的生物體提供方法支撐,使得科研人員可以在系統層面上進行深度功能測試,促進工程生物學的產品轉化;更好地推動定量工程生物學、生物醫學及臨床醫學的發展.

　　參考文獻

　　1ZhangXE.SyntheticbiologyinChina:Reviewandprospects(inChinese).SciSin-Vitae,2019,49:1543–1572[張先恩.中國合成生物學發展回顧與展望.中國科學:生命科學,2019,49:1543–1572]

　　2MartinVJJ,PiteraDJ,WithersST,etal.EngineeringamevalonatepathwayinEscherichiacoliforproductionofterpenoids.NatBiotechnol,2003,21:796–802

　　作者：王蕾1,2†,黃建東1†,楊舒心1,黃術強1,2*,李楠1,2*