摘要：神經元之間的信息傳遞主要依賴于神經遞質釋放到細胞外的化學信號傳導。用于研究神經遞質釋放的方法有很多種。本文旨在為神經遞質研究提供全面而重要的技術概述。首先，本文介紹了這些技術的基本原理及其進展;其次，對這些方法的重要性和應用進行了討論。在應用示例中，介紹了若干技術的發展，例如光學方法中的熒光染料傳感器。最后本文對此類研究的最新趨勢進行了總結。

　　儀器論文投稿刊物：《儀器儀表與分析監測》論文發表多久見刊 是由北京京儀集團有限責任公司主管，北京京儀儀器儀表研究總院有限公司主辦。是儀器儀表與監測領域國內外公開發行的專業性科技期刊,自85年元月創刊以來受到業內人士的好評及認可,目前已入選"中國科技期刊綜合評價數據庫統計源期刊"同時被中國期刊網全文收錄,應科技信息化的要求正積極面向市場,望各個企業大力支持,本刊專業范圍為:電力、水利、石油、化工、冶金、建筑、汽車、船舶、醫療及技術監測與資料分析;各類儀器儀表、信息技術在以上及相關領域內的應用.

　　關鍵詞：神經遞質遞質釋放囊泡釋放

　　囊泡主要集中在每個神經元的突觸前神經末梢。它們儲存神經遞質并在動作電位使突觸前膜去極化時"申經遞質釋放后與突觸后膜上的受體結合，釋放的神經遞質的種類決定了下游神經元是去極化還是超極化。在胞吐作用后，囊泡發生內吞，再循環并重新填充神經遞質。已知囊泡表面的蛋白就有大概40種左右(1),參與其釋放的蛋白也有很多種，這些分子蛋白相互作用，高度有序，并且受到了精密控制2。其失調可導致許多身體和心理的疾病，如帕金森病，阿爾茨海默病，抑郁癥，藥物成癮和癲癇。研究神經遞質釋放的過程，不僅會對神經生物學基礎理論研究產生積極的影響，也將揭示與其相關的重大疾病理論機理，為其治療提供新的靶點。

　　1目前研究方法

　　1.1電鏡

　　電鏡方法主要用于測量囊泡的一些物理特征，比如說囊泡的大小，分布，密度和形態。透射電子顯微鏡(TEM)是用于描述囊泡特征的最普遍的技術,在透射電鏡中，聚焦的電子束通過薄樣本傳輸以產生樣本圖像。處理樣品的重金屬如四氧化鋨和醋酸鈾使脂質膜產生對比。TEM具有卓越的分辨率。另外,TEM還可與免疫標記(免疫EM)結合，以提供分子特征3。掃描電子顯微鏡(SEM)是研究囊泡的一種成熟且有用的技術.掃描電鏡通過用聚焦的電子束掃描囊泡表面來觀察囊泡&電子與樣品中的原子相互作用，產生各種可誘導信號，提供三維表面形貌信息以及樣品的元素組成。

　　主要用于研究胞外的囊泡⑷。由于絕大多數關于囊泡的掃描電鏡的研究是在真空下進行的，因此樣品通常是固定和脫水的。冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)是電鏡的一種形式，其中樣品在非常低的溫度(例如，-100°C)下進行分析.與需要大量樣品固定和染色的SEM或TEM不同，冷凍電鏡在冷凍條件下分析樣品中囊泡，避免受到脫水和化學固定劑的影響5。

　　1.2光學

　　由于熒光染料的開發和顯微成像技術的發展，使用光學方法檢測囊泡實時釋放的應用越來越多(R。FM1-43是研究囊泡釋放的常用的膜表面熒光標記物，其在水相中不發熒光，插入脂質膜后則產生較強的熒光，因此囊泡釋放后細胞的膜表面熒光強度增加，而囊泡胞吞時因為吞進周圍的染料而被熒光標記，這樣便能夠實時觀察遞質釋放的過程,此方法背景熒光較大。另一種背景熒光小的方法是通過轉基因將熒光基因如綠色熒光蛋白(GFP)基因轉入靶細胞并選擇性地在囊泡膜上表達()。

　　YulongLi等最近通過在乙酰膽堿，多巴胺和去甲腎上腺素受體特定位置嵌入循環重排的熒光蛋白，當神經遞質釋放后，作用到受體時，激活的受體構象就會發生變化，構象的變化就會導致熒光蛋白的熒光信號發生改變，進而反映對應神經遞質的濃度變化。LinTian小組也開發了類似的探針。這種傳感器不僅在監測神經遞質釋放方面具有高度選擇性，而且在體內和離體模型中也提供了非常高的時間(亞秒)和空間分辨率(從全腦切片到單個神經元)[911]同時克服了基于G蛋白偶聯受體的傳感器在體內使用的一些限制[12]。

　　并且應用范圍從單細胞到在體清醒模型都可以。全內角反射熒光顯微鏡(TotalInternalReflectFluorescenceMicroscopy，TIRFM)方法的原理是利用光在高折射率和低折射率的交界面，當入射角達到或超過某個臨界角度時，發生全反射形成隱失場，使用隱失場激發熒光樣品，激發的厚度大概只有100nm,其它的熒光基團不會被激發，因此信噪比很高，特別適合神經遞質釋放和內吞方面的研究應用。

　　1.3電學

　　1.3.1膜電容

　　膜電容方法是通過膜片鉗放大器記錄細胞膜表面積的變化來估算刺激的細胞胞吐所引起電容變化的方法。膜電容與細胞的表面積成正比，當分泌的囊泡與胞膜融合時，膜電容增加。此方法主要用于單細胞和組織切片，用于檢測標本的范圍比較窄。

　　1.3.2突觸后電流

　　此方法就是利用釋放的神經遞質作用到突觸后特異性受體引起電流來研究神經元遞質釋放�？斓呐d奮性和抑制性遞質如谷氨酸，!一氨基丁酸(GABA),和乙酰膽堿可以直接激活離子通道，記錄到突觸后細胞或膜片的電流。這個技術被廣泛的用于研究腦組織中GABA和谷氨酸釋放的調節，自發性的突觸后電位頻率與動作電位誘發的遞質釋放的概率有關(13)。

　　1.4電化學技術

　　電化學技術的原理是：給予電極表面一定的電壓，容易氧化的神經遞質就會在電極表面發生氧化反應而釋放電子，電極獲得電子并產生電流。由于碳的電化學特性穩定，材質堅韌，且原材料容易獲得，也容易加工成直徑小的纖維(5〜35#m),對組織損傷小，因此電化學電極原料大多為碳。碳纖電極：電化學方法在生物體的應用主要是恒壓安培法和循環伏安法。前者的優點是時間分辨率高，后者的優點是能區分不同的信息分子。1973年Adams等將碳電極植入麻醉大鼠的大腦中，并且證明了傳統的伏安法可以應用于生物組織。盡管當時所記錄的信號可能是抗壞血酸而非多巴胺，但這項工作的重要性是證明了神經遞質可以擴散到突觸間隙外的電極表面，如果這種情況不存在,在體電化學測量是不可能的[14]。

　　在這之后，該技術被廣泛應用,電化學方法用于腦片中的神經遞質測量始于上世紀70年代，而應用于單細胞遞質分泌測量則是在90年代Wightman小組完成(15)。而在進入20世紀后，Wightman小組又率先實現了自由活動狀態的大鼠的多巴胺記錄[16]。電極可以分為柱狀電極和點狀電極。柱狀電極主要應用于在體和腦片,檢測的是很多囊泡的釋放，空間分辨率達不到單個囊泡的水平。點狀電極主要應用于單細胞，無論是時間(毫秒)還是空間分辨率(單囊泡)都能保證對分泌囊泡數量、單個囊泡的容量等研究的需要[17'18]。

　　酶修飾電極：由于碳纖電極只能檢測可以被氧化的神經遞質，主要是多巴胺和去甲腎上腺素，但有很多重要的神經遞質不能被500〜700mM的電壓所氧化，通常通過對電極表面固定特定的氧化酶從而形成h202來完成分析物檢測。例如，主要興奮性神經遞質谷氨酸的檢測可以通過谷氨酸氧化酶來實現，谷氨酸氧化酶將谷氨酸轉化為$-酮戊二酸和h2o2(19]o由于酶的動力學可以減慢這種測量的時間分辨率，因此基于酶的傳感器通常與安培法聯合。已經開發了許多種基于安培法的酶的傳感器，包括谷氨酸(19),乙酰膽堿(0)及其前體膽堿(1)和腺苷血。

　　1.5微透析-高壓液相色譜-電化學檢測方法

　　微透析(Microdialysis):微透析技術是將灌流取樣和透析技術結合用于活體組織動態微量采樣的技術。其原理是將具有透析作用的探針埋入目標組織內，用微量注射泵以恒定速度向探針內灌注與組織液成分相近的等滲灌流液，與待測的組織進行物質交換后被引流出。聯合高壓液相色譜檢測技術便可檢測特定組織內生物活性物質的變化。此技術具有活體取樣，定量分析，動態監測等優點。

　　高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography，HPLC)色譜法又稱層析法，是常用的分離物質的方法。其原理為溶質在流動相和固定相之間進行的連續多次交換過程。由于溶質在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。根據各組分在固定相中保留時間不同，就可以定性定量檢測神經遞質。

　　2討論和應用

　　電鏡技術是神經元中遞質釋放的傳統研究方法，電鏡的空間分辨率是其它方法無法企及的，BernardKatz根據記錄到的終板電位的固定振幅的小的自發去極化，提出了量子假說(3)。然而，只有在電鏡中看到突觸囊泡才使其量子假設細化為囊泡假說。另外Palade提出的囊泡運輸假說也是根據電鏡結果得出的[24]。需要以納米分辨率成像的膜和蛋白質的研究，離不開電鏡方法。與免疫電鏡相比，最近的超微結構研究利用可切換的熒光蛋白質將電子顯微鏡和超分辨率顯微鏡結合成像(稱為納米-fEM)[Z5]，大大提高了標記的靈敏度。

　　通過光學的方法，可以直接實時動態觀察到熒光標記的分泌囊泡。這樣就可以看到囊泡釋放的一系列進程。在最近的一項研究中,Kylachko及其同事利用高熒光強度苯乙烯基染料SGC5,檢測了自發的或由動作電位誘發的染料攝取后單個突觸囊泡的運動軌跡[26]，發現自發的釋放引起內吞的囊泡的活動范圍比動作電位引起的內吞的囊泡更小。

　　另外，熒光蛋白可以通過電穿孔，病毒注射或基因組整合來表達，從而可以穩定和長期表達，用于長期監測神經元活動。另外還可以通過使用特異性啟動子或定位序列來實現靶向神經元亞型或細胞器�？傊�隨著染料和顯微鏡以及圖像傳感器的發展，光學的方法越來越受到科研工作者的青睞。電學方法也可以用來實時檢測囊泡的分泌，該技術的優點是對囊泡釋放的時間分辨率高。興奮性突觸后電流和抑制性突觸后電流常用來檢測谷氨酸和氨基丁酸的釋放，但此方法是突觸前釋放的神經遞質作用到突觸后受體的綜合結果，本質上是一種間接的方法，而且受到神經遞質的擴散和消除,受體失敏和受體飽和等影響。

　　從突觸后反應中獲得突觸前行為需要復雜的反卷積算法，這些算法依賴于對實驗條件的假設。另一個常用的電學方法膜電容測量則是對囊泡釋放的直接測量。常用來研究遞質釋放與離子通道以及細胞內第二信使的關系。此方法為研究囊泡的活動如膜融合動力學、膜融合的分子調控等提供了強大的工具。但由于胞吐同時伴隨胞吞，胞吞導致的囊泡膜的回收會使膜電容減少。此方法還有一個假設就是囊泡內含有神經遞質，囊泡完全與胞膜融合以及囊泡內的神經遞質完全釋放，但已經證實還存在其它的釋放方式。還有就是此方法對實驗條件如封接電阻(Rm)、串聯電阻(Rs)的要求很高，對于一些復雜結構如神經軸突終末、或與周邊細胞有電學偶聯的細胞等則不能使用該技術。

　　總體來說電學的方法雖然具有高分辨率的優勢，但都主要應用在單細胞或腦片層面上，用于在體研究神經遞質傳遞的比較少。在體腦內神經遞質的研究主要依賴于微透析-高壓液相色譜和電化學微電極檢測方法。通過微透析結合高壓液相色譜來采樣和測定腦內神經遞質的變化，其分析過程比較長，樣品收集時間間隔為5"30分鐘。時間分辨率比較低，無法實時測定腦內神經遞質濃度的變化。

　　它的優點在于它的很高的靈敏度和分辨率，缺點在于它的時間和空間分辨率不夠高。這些年電化學微電極發展也取得了很大的進步，在在體水平和腦片水平上以及單細胞水平上都能記錄多種神經遞質的釋放。時間和空間分辨率都優于微透析-高壓液相色譜�，F在很多關于神經遞質的研究都是結合多種方法，例如在有些蛋白丟失其功能的情況下，囊泡的分布會發生變化，同時其動力學也可能會發生變化，這時候電學結合電鏡或光學的方法就會使時間和空間分辨率都很高而如果囊泡的大小發生變化，除了電鏡觀察囊泡的直徑外，還可以測突觸后電流或用微碳纖電極來進一步驗證。

　　2018年ShinW研究囊泡釋放動力學就用到了電容，電鏡和光學跑。而ZhouZhuan實驗組最新發現的一種新的不依賴于鈣離子的分泌方式也涉及到了電容，電鏡和全內反射顯微鏡等多種研究方法(9)。這些方法的結合可以相互彌補各自的缺點，同時又相互印證。