摘要：紅景天苷是紅景天屬(Rhodiola L.)植物的主要代謝物質，具有非常重要的藥用價值。為保護野生植物資源，同時滿足巨大的市場需求，探討紅景天苷的人工合成途徑尤為重要。本文主要從紅景天苷化學合成現狀、紅景天苷生物合成途徑、代謝工程改造菌株合成紅景天苷三方面對紅景天苷的人工合成途徑進行綜述，以期為后續紅景天苷合成相關研究提供理論參考。

　　關鍵詞：紅景天苷;化學合成;代謝途徑;生物合成

　　0 引 言

　　紅 景 天 苷(Salidroside)是 紅 景 天 屬(RhodiolaL.)植物的重要活性物質，廣泛應用于食品醫藥領域。紅景天苷主要來源于紅景天屬植物的根莖和塊莖[1]，隨著紅景天苷的植物提取技術[2，3]和合成手段日臻成熟，研究者對紅景天苷的藥理作用進行了多項研究。藥理研究表明，紅景天苷具有抗缺氧[4]、保護神經系統[5]、消炎[6]、抗腫瘤[7，8]、血糖調節[9]、改善心血管系統[10]、提高免疫力[11]的作用，在預防和治療腦缺血損傷[12]、腦卒中[13]、阿爾茲海默癥[5]、糖尿病及其并發癥[14]、脂肪型肝炎[15，16]、動靜脈血栓[17]、癌癥[18]等 多 項 疾 病 中 有 巨 大 的 潛 力 ，臨 床 應 用 前 景廣闊。隨著紅景天苷藥理作用的不斷發現，其市場需求量與日俱增。紅景天苷最先源于從紅景天屬植物中提取，人為過度采集、生境的破壞致使紅景天野生植物資源日漸枯竭。

　　2021 年國務院發布的《國家重點保護野生植物名錄》將十一種紅景天屬植物列為國家二級保護植物，大花紅景天〔Rhodiola crenula⁃ta(Hook. f. et Thoms.)H. Ohba〕、薔 薇 紅 景 天(Rhodiola rosea L.)及其他多種常用藏藥紅景天均收錄在內。一方面，紅景天屬野生植物資源瀕危，且普遍存在紅景天苷含量低、提取率低的問題。另一方面，紅景天屬植物生存環境非常特殊，如高海拔、高輻射、干旱、缺氧等，人工種植紅景天成本高且難以達到標準[19]。為了保護紅景天屬野生植物資源并且滿足市場對紅景天苷的巨大需求，科研工作者開始嘗試人工合成紅景天苷。人工合成紅景天苷可通過化學合成和生物合成兩種方式實現。化學合成紅景天苷多需要嚴苛的反應條件和昂貴的催化劑，且易生成難以除去的副產物。隨著紅景天苷生物合成通路逐漸明晰，通過基因工程技術構造工程菌株合成紅景天苷具有廣闊的應用前景。

　　1 紅景天苷的化學合成現狀

　　1969 年 ，蘇聯學者 Troshchenko[20]就報道了紅景天苷的合成方法，溴代四乙酰基吡喃葡萄糖與酪醇在堿性條件下進行糖苷化反應生成中間產物四乙酰基紅景天苷，四乙酰基紅景天苷脫乙酰基得到紅景天苷。以對羥苯乙醇作為原料，在無水氯化錫催化下進行糖苷化反應 ，再經脫保護機制得紅景天苷[21]。成本較低且反應路線較短，大大提高了紅景天苷的產率。以上方法屬于酪醇的直接糖苷化，酪醇中同時存在酚羥基和醇羥基，酚羥基也會隨醇羥基一同發生糖苷化，生成的副產物難以除去。保護酚羥基使之不被糖苷化，可提高紅景天苷的純度。分別使用芐基、烯丙基保護酪醇的酚羥基，再與溴代四乙酰基吡喃葡萄糖縮合生成四乙酰基紅景天苷，四乙酰基紅景天苷脫乙酰基得到酚羥基保護的紅景天苷，最后再脫去保護基團生成紅景天苷[22，23]。

　　除芐基、烯丙基以外，酚羥基還可用乙酰基進行保護。以對羥苯乙酸為原料，經乙酰化保護、還原、苷化醇解三步反應合成紅景天苷，減少了反應步驟，提高收率[24]。即使是使用酚羥基保護的酪醇與 1⁃溴⁃四乙酰基吡喃葡萄糖反應合成紅景天苷，合成過程也非常困難：使用碳酸銀作催化劑時，需要過量才能達到較好的催化效果，成本高且不穩定;為避免銀雜質殘留，還需要進行柱層析除雜純化產品;溴代四乙酰基吡喃葡萄糖制備過程復雜且費用高昂，儲存時也需要低溫干燥存放。這些問題使得整個合成過程受到限制，較難實現工業化生產。2016 年，有學者以全乙酰基葡萄糖與 4⁃芐氧基苯乙醇作為原料，以路易斯酸和鹵化鎂作為催化劑，合成紅景天苷，總收率達63%，在一定程度上解決了原料不穩定且合成過程成本高的問題[25]。

　　以價廉易得的 β⁃D⁃五乙酰葡萄糖為糖苷化供體，以無水 ZnCl2催化苯甲酰基保護的酚羥基酪醇進行糖苷化反應，再經脫保護得到紅景天苷[26]。路線涉及的中間體均可通過重結晶代替柱層析進行純化，顯著降低了生產成本，具備可放大性。目前合成紅景天苷的化學合成方法反應條件比較嚴苛，紅景天苷的生物安全性較難保證。相比之下，生物合成具有成本低、效率高、選擇性強且污染少的優勢。隨著基因工程、代謝工程的發展，構建高效 的 微 生 物 細 胞 工 廠 生 產 紅 景 天 苷 成 為 了 研 究熱點。

　　2 紅景天苷的生物合成現狀

　　2. 1 紅景天苷的生物合成途徑

　　通過基因工程改造微生物合成紅景天苷的方法難點在于理清紅景天苷的天然合成通路，以此為參考在微生物體內實現紅景天苷合成通路的重構。酪醇是紅景天苷的苷元分子，在關鍵酶尿苷二磷酸葡萄 糖 基 轉 移 酶(uridine diphosphate glucosyltransfer⁃ase，UGT)的催化作用下，尿苷二磷酸葡萄糖(uri⁃dine diphosphate glucose，UDPG)作為糖基化供體，酪醇發生糖苷化生成紅景天苷[27，28]。酪醇的代謝途徑尚未明確，作為芳香類氨基酸衍生物，被認為與植物的莽草酸代謝途徑相關[29]。

　　磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)和赤蘚糖⁃4⁃磷酸(ery⁃throse 4⁃phosphate，E ⁃4⁃P)經莽草酸代謝途徑生成莽草酸，再經酶促反應生成阿羅酸，阿羅酸進而轉化為酪氨酸、苯丙氨酸或其他芳香類物質。最初有研究者認為酪醇的前體是苯丙氨酸和酪氨酸[30]，李偉等[31]測 定 了 狹 葉 紅 景 天〔Rhodiola kirilowii(Re⁃gel)Maxim.〕愈傷組織中紅景天苷的含量與苯丙氨酸 解 氨 酶(L ⁃phenylalanine ammonia ⁃lyase，PAL)、肉桂酸⁃4⁃羥化酶(cinnamate 4⁃hydroxylase，C4H)、酪 氨 酸 解 氨 酶(tyrosine ammonialyase，TAL)的 活性，發現紅景天苷含量與三種代謝酶活力之間都有顯著性差異，且這種顯著性差異呈不規則變化。

　　研究者推測，在不同溫度培養條件下，紅景天苷合成有時以酪氨酸代謝為主，有時以苯丙氨酸代謝為主。為了進一步探究紅景天苷的來源，在高山紅景天中分別過表達苯丙氨酸解氨酶[32]和酪氨酸脫羧酶(ty⁃rosine decarboxylase，TyrDc)[33]后測定紅景天苷和酪醇的含量，發現二者的含量與 TyrDc 的表達量呈正相關關系，與 PAL 的表達量呈負相關關系。這一實驗結果支持酪醇來自酪氨酸代謝途徑這一推測，在薔薇紅景天中得到了同樣的結論[34]。目前，研究者多認為紅景天苷和酪醇的前體物質為酪氨酸，并推測酪氨酸可經由三條途徑生成酪醇。

　　酪氨酸經由酪氨酸脫羧酶的催化生成酪胺，單氨氧化酶催化酪胺生成對羥苯乙醛(4⁃hydroxyphenylac⁃etaldehyde，4⁃HPAA)，后者又在醇脫氫酶的催化下還原生成酪醇;酪氨酸在酪氨酸轉氨酶的催化下生成 對 羥 苯 丙 酮 酸(4 ⁃ hydroxyphenylpyruvate，4 ⁃HPP)，對羥苯丙酮酸脫羧生成對羥苯乙醛，對羥苯乙醛還原生成酪醇[35];酪氨酸可直接經由對羥苯乙醛 合 酶(4 ⁃ hydroxyphenylacetaldehyde synthase，4HPAAS)的催化生成對羥苯乙醛，繼而經過還原反應生成酪醇[36]。尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶作為整個過程的限速酶，一直備受科研工作者關注。2007 年，首次從高山紅景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor.)中克隆并鑒定得到參與紅景天苷生物合成的 UGT，將其命名為 UGT73B6[37]。這使微生物合成紅景天苷成為可能。運用體外酶活實驗和紅景天轉基因毛狀根系統 兩 種 方 式 證 明 來 自 高 山 紅 景 天 的 UGT74R1 和UGT72B14 也 具 有 將 酪 醇 轉 化 為 紅 景 天 苷 的 能力[38]。

　　篩選 12 個來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的 UGT，異源表達到高產酪醇的大腸桿菌(Esche⁃richia coli)中，分別表達 AtUGT73C5，AtUGT73C6和 AtUGT85A1 的大腸桿菌生成了紅景天苷，其中表達 AtUGT85A1 的大腸桿菌發酵液中紅景天苷含量最高[39]。2018 年，在煙草(Nicotiana tabacum L.)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)兩種表達系統里異源表達來自薔薇紅景天的 UGT 和 4HPAAS重新構建了紅景天苷的代謝途徑，研究結果發現異源 表 達 了 RrUGT29，RrUGT32 和 RrUGT33 的 釀酒酵母和煙草成功合成了紅景天苷[36]。目前微生物生產紅景天苷中使用的 UGT 主要包括以上三個物種來源。

　　除了尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶外，工程菌改造的過程中應用非常廣泛的一個酶是芳香乙醛合酶(aromatic aldehyde synthase，AAS)。在 2002 年，研究者為促進馬鈴薯中酪胺的積累轉入了來自歐芹〔Petroselinum crispum(Mill.)Hill〕的 PcTyrDc ⁃ 2，結果并沒有提高酪胺的含量，反而生成了新的代謝物質——紅景天苷。研究者猜測馬鈴薯中紅景天苷的合成途徑應從酪胺起始，經催化生成對羥苯乙醛，再經還原和糖苷化生成紅景天苷，但對此并未給出證據[40]。發現 PcTyrDC ⁃2 表現出芳香乙醛合酶的催化特性，可將酪氨酸直接催化生成對羥苯乙醛，并將其正式歸于芳香乙醛合酶[41]。因其直接以酪氨酸為底物合成對羥苯乙醛，反應簡單、高效，來自歐芹的芳香乙醛合酶被廣泛應用于高產紅景天苷工程菌株的改造。

　　2. 2 大腸桿菌作為底盤生物合成紅景天苷大腸桿菌繁殖周期短、操作簡單，且遺傳背景清晰，因此近些年有較多研究者選擇大腸桿菌作為底盤生物進行適當改造用以生產紅景天苷。目前在大腸桿菌中可以通過引入來自釀酒酵母的 Aro10p，來催化對羥苯丙酮酸生成對羥苯乙醛，對羥苯乙醛進而在大腸桿菌內源還原酶的作用下生成酪醇，酪醇經糖苷化生成紅景天苷。為了提高紅景天苷的產量，首先要構建高產酪醇的工程菌，工程菌的改造主要圍繞減弱酪氨酸的負反饋抑制、改變代謝通路流量和增加通路蛋白表達量三方面展開。

　　引入酪氨酸反饋抑制不敏感突變體基因 aroGD146N和tyrAM53I/A354V可減弱酪氨酸的反饋抑制[42];敲除酪氨酸代謝途徑中的 tyrB、tyrE[43]、苯丙氨酸代謝途徑中的 peaB、pheA、pabB 可減弱競爭代謝途徑以增加酪醇的代謝通量[44，45];TyrR 是芳香族氨基酸合成過程中的轉錄抑制因子，敲除 tyrR 可有效增加通路蛋白的表達量，也可通過過表達莽草酸代謝途徑中的基因提高蛋白的表達量[46]。在完成酪醇高產突變株的構建后，再引入外源 UGT 即可實現大腸桿菌內紅景天苷合成途徑的重構。本文在現有研究的基礎上對大腸桿菌中紅景天苷的合成途徑進行了重新梳理。在使用大腸桿菌表達 UGT 蛋白時，進行密碼子優化是非常重要的。在高產酪醇的大腸桿菌中異源表達了經過密碼子優化的 UGT72B14，經過優化后的酶活性不受影響，且表達量更高，純度更好，紅景天苷的產量可達 6. 7 mg/L[47]。

　　在大腸桿菌中敲除了 pheA、feaB、tyrR 等基因，異源表達來自釀酒酵母的 Aro10p，以提高酪醇的產量[42]。在此基礎上引入來自高山紅景天的糖基轉移酶 UGT73B6，紅景天苷產量高達 56. 9 mg/L。這是首次在大腸桿菌中實現紅景天苷的從頭合成。但是 UGT73B6 的立體選擇性較差，在合成紅景天苷的同時，也會生成淫羊藿次苷 D2(Icariside D2)，酪醇轉化效率低。為了進一步提高 UGT 的選擇性與催化效率，對來自擬南芥的12 個 UGT 進行篩選，將 12 個 UGT 分別轉入大腸桿菌中，并且在培養基中加入酪醇，以大腸桿菌中紅景天苷的含量表征 UGT 的催化效率，其中 AtUGT85A1 的催化效率最高[39]。作者將來自歐芹的 PcAAS和來自擬南芥的 AtUGT85A1 轉入大腸桿菌中，將紅景天苷的產量提高至 288 mg/L。AtUGT85A1 催化效率高且具有立體選擇性，不會發生酚羥基糖苷化生成淫羊藿次苷 D2，成為后續生物合成紅景天苷的常用 UGT。

　　通過改造內源蛋白、表達來自釀酒酵母的 ARO10p 和來自擬南芥的 AtUGT85A1，獲得了一株紅景天苷的高產菌株，紅景天苷產量達 9. 3g/L[43]。 以 上 均 為 使 用 單 一 工 程 菌 株 生 產 紅 景 天苷。隨著微生物共培養技術的發展，研究者開始嘗試使用微生物共培養技術生產紅景天苷。將紅景天苷的生物合成途徑分配在兩個菌株中，苯丙氨酸缺乏的苷元菌株以木糖為碳源合成酪醇，酪氨酸缺乏的糖基化菌株以葡萄糖為碳源以酪醇為底物生成紅景天苷[48]。二者互利共生，在以葡萄糖和木糖為碳源時紅景天苷產量達 6. 03 g/L。為了實現對微生物共培養期培養環境的監測與調控，研究者引入了群體感應技術，利用數學建模的方法分析了多個群體感應系統，不斷優化微生物共培養和代謝調控方案，在工業上具有較大的應用前景[49]。

　　2. 3 釀酒酵母

　　作為底盤生物合成紅景天苷釀酒酵母也是一種常用的工程菌，因其無內毒素 ，在 食 品 和 醫 藥 領 域 有 著 悠 久 的 應 用 歷 史 ，被FDA 認定為安全菌株。不同于大腸桿菌，釀酒酵母體內本身就存在可將酪氨酸轉化為酪醇的 Ehrlich途徑。雖然釀酒酵母本身可以生產酪醇，但是產量很低，在改造釀酒酵母高效合成紅景天苷之前，首先要提高酪醇的產量。

　　PEP 和 E⁃4⁃P 是酪醇合成的底物，野生釀酒酵母中生成的 PEP 主要流向丙酮酸代謝途徑，僅有少部分流向莽草酸代謝途徑，將丙酮酸代謝途徑中的 pdc1 敲除，有利于提高酪醇的產量。另一方面，分支酸是芳香酸和酚類化合物生物合成途徑中的主要分支點中間代謝物，被分支酸變位酶和預苯酸脫氫酶連續轉化為對羥苯乙醛[50]。其中，Aro3p、ARO4p、ARO7p 的活性受酪氨酸的反饋抑制，這是釀酒酵母作為底盤生物合成芳香類物質的瓶頸[51]。引入內源的酪氨酸反饋抑制不敏感突變體[52]Aro3pK222L、Aro4pK229L、Aro7pG141S 或 來 自 大 腸 桿菌的酪氨酸反饋抑制突變體[53]EcTyrAM53I/A354V 可以減弱酪氨酸對整個代謝過程的抑制作用。另外，還可以通過異源表達來自歐芹的 PcAAS 催化酪氨酸直接生成對羥苯乙醛來增加酪醇的代謝通量。在酪醇高產突變株中引入 UGT 即可實現釀酒酵母內紅景天苷合成通路的重構。

　　2. 4 紅景天屬植物內生菌合成

　　紅景天苷目前主要以大腸桿菌和釀酒酵母作為生產紅景天苷的工程菌株，除此之外，有研究學者發現紅景天屬植物的一些內生菌也具有合成酪醇和紅景天苷的能力。在高山紅景天的根部篩選得到一株可以代謝生成紅景天苷的內生真菌，經鑒定屬于曲霉(Asper⁃gillus)[57];在大花紅景天根部篩選得到一株可以生產酪醇的水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)，在最佳發酵條件下，產量達 15. 68 mg/L[58];在高山紅景天的 內 生 菌 中 分 離 得 到 一 株 內 生 菌 福 廷 瓶 頭 霉 菌(Phialocephala fortinii)，經過發酵條件優化，紅景天苷和酪醇的產量分別為 2. 339 mg/mL 和 2. 002 mg/mL[59]。目前利用紅景天屬植物內生菌生產紅景天苷的研究較少，且研究者大多把目光聚焦在可天然合成酪醇和紅景天苷的菌株篩選這一方面，缺少對其合成機制的解析，探索這些植物內生菌中天然的紅景天苷合成途徑有助于發現新的代謝通路或者催化效果更好的酶，進而用于紅景天苷工程菌的改造。

　　3 展 望

　　人工合成紅景天苷主要通過化學合成和生物合成兩種途徑。化學合成法過程復雜、產率低且安全性得不到保障。因此，生物合成法生產紅景天苷是未來發展的趨勢，在工業化生產中有著廣闊的應用前景。為提高生物合成紅景天苷的產量，仍需解決以下問題。紅景天苷的天然合成途徑需要更深入地挖掘。紅景天屬植物作為紅景天苷最主要的天然來源，基因組學、轉錄組學和代謝組學資源均非常匱乏，有關紅景天苷生物合成的通路及其關鍵基因的研究，依然缺乏清晰的遺傳背景，植物體內真實的紅景天苷天然代謝途徑和調控機制依然懸而未決，這極大地限制了紅景天苷的可持續利用。酪醇的轉化效率較低是紅景天苷產量的一大限制因素。目前鑒定得到的可以高效催化酪醇轉化為紅景天苷的 UGT 寥寥，發現更多催化效率高、立體選擇性好的 UGT 可從生物信息學的角度入手，通過整合現有的序列和結構資源，分析序列特征、底物結合位點和催化活性結構域，在所有生物的基因數據庫中高效率地實現酶的鑒定、篩選及改造。

　　當下雖然已經實現了利用大腸桿菌和釀酒酵母為底盤生物合成紅景天苷，但是生產工藝還停留在實驗室水平，提高苷元分子酪醇的代謝通量是提高紅景天苷產量行之有效的手段。提高工程菌株中苷元分子酪醇的代謝通量，可通過解除反饋抑制、過表達關鍵酶、抑制競爭途徑等方法對底盤生物進行更加完善的改造實現。釀酒酵母存在酪醇的天然合成途徑，相比大腸桿菌，使用釀酒酵母作為底盤生物構造酪醇高產突變株具有更大的潛力。相信隨著紅景天苷天然合成通路不斷被解析，對于底盤生物的改造也會更有選擇性，更為高效。

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　　作者：宋小利，劉 星