摘 要：采用薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)法對(duì)樣品中的甲基麥冬黃烷酮 A 進(jìn)行定性鑒別以示區(qū)別山麥冬;參照 2020 版《中國(guó)藥典》附錄相關(guān)方法，測(cè)定樣品中總灰分、干燥失重和重金屬;參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》相關(guān)方法，測(cè)定樣品中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸菌群和沙門氏菌;采用紫外 -可見分光光度(ultraviolet and visible spectrophotometry，UV)法測(cè)定樣品中總皂苷和總黃酮含量;采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定樣品中麥冬皂苷 D 含量。結(jié)果表明，薄層色譜中供試品與對(duì)照品在相同位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。總灰分為 0.695% ～ 0.857%，干燥失重為 8.074% ～9.013%，銅含量為 15.024 ～ 16.037mg/kg，鉛含量為 0.728 ～ 0.826mg/kg，砷含量為 0.662 ～ 0.815mg/kg，汞含量為 0.073 ～ 0.087mg/kg，鎘含量為 0.166 ～ 0.182mg/kg;菌落總數(shù)均小于 103 CFU/g，霉菌和酵母菌數(shù)均小于 102 CFU/g，未檢出大腸桿菌和沙門氏菌;總黃酮含量為 9.17 ～ 10.12mg/kg，總皂苷含量為 31.70 ～32.99mg/kg;麥冬皂苷 D 含量為 0.287 ～ 0.308mg/kg。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法可控性高、可操作性和專屬性強(qiáng)，可為于川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：川麥冬須根;提取物;薄層色譜法;高效液相色譜法;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

　　麥 冬 為 百 合 科 植 物 麥 冬(Ophiopohonjaponicus(L.f)Ker-GawL.)的干燥塊根，為臨床常用中藥，具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心功效，用于治療肺燥干咳、陰虛勞嗽、喉痹咽痛、內(nèi)熱消渴等癥[1]。麥冬化學(xué)成分主要為甾體皂苷類、高異黃酮類和多糖類等成分，其中前兩者是麥冬的主要活性部位[2-3]，具有降血糖、保護(hù)心血管系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫、抗炎、抗腫瘤、延緩皮膚衰老等作用[4-10]。四川省三臺(tái)縣和浙江杭州筧橋一帶分別作為川麥冬和浙麥冬的道地產(chǎn)區(qū)，其中以川麥冬產(chǎn)量最大。大量研究表明，麥冬須根活性成分、藥理作用與塊根相似，總皂苷和多糖含量高于塊根[11-14]，傳統(tǒng)加工過程中麥冬須根的棄用造成了極大資源浪費(fèi)。2019 年 4 月，四川省發(fā)布了《麥冬須根食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)》[15]，正式將川麥冬須根列為新資源食品，在大健康理念的背景下，麥冬須根在藥食同源、保健食品方面顯示出極大的開發(fā)價(jià)值及應(yīng)用前景。

　　當(dāng)前，有關(guān)川麥冬須根提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未見相關(guān)報(bào)道，研究擬在研制出川麥冬須根提取物的基礎(chǔ)上[16-17]，對(duì)其進(jìn)行規(guī)范化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，以期為川麥冬須根提取物產(chǎn)業(yè)化有效控制質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 試劑與材料

　　川麥冬及其須根采收于四川省三臺(tái)縣花園鎮(zhèn)麥冬種植基地，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校金虹教授鑒定為百合科植物麥冬(Ophiopogonjaponicus(L.f.)Ker-Gawl.)及其須根。川麥冬須根提取物為須根經(jīng)水和乙醇提取、濃縮和純化、精制加工制成的黃棕色粉末。蘆丁(純度≥ 98%)、魯斯可皂苷元(純度≥ 98%)、山麥冬藥材：中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲基麥冬黃烷酮 A(純度≥ 98%)、麥冬皂苷 D(純度≥ 98%)：成都曼思特生物科技有限公司;乙腈(色譜純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、高氯酸(分析純)：成都科隆化學(xué)品有限公司;水為超純水。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　LC1525 型高效液相色譜儀(配有蒸發(fā)光檢測(cè)器及 Labsolutions 工作站)：美國(guó) Waters 公司;UV-1100 型紫外 - 可見分光光度計(jì)：中國(guó)上海天美科技有限公司;BP121S 型電子分析天平：北京 Sartorius 天平有限公司;SB-3200DTDN 型超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司;W202B 型數(shù)控恒溫浴鍋：上海申勝生物技術(shù)有限公司;BPH-9042 恒溫培養(yǎng)箱：上海儀天科學(xué)儀器有限公司;LB-JL2 菌落計(jì)數(shù)器：青島路博偉業(yè)環(huán)保科技有限公司。

　　1.3 試驗(yàn)方法

　　1.3.1 薄層色譜鑒別稱取川麥冬須根提取物 0.5g，加三氯甲烷 -甲醇(7∶3)混合溶液 20mL，超聲 30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)�加三氯甲�?0.5mL 使溶解，作為供試品溶液。分別稱取麥冬、山麥冬粉末各 2g，加三氯甲烷 - 甲醇(7∶3)混合溶液20mL，浸泡 3h，超聲 30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)�加三氯甲�?0.5mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取甲基麥冬黃烷酮 A 對(duì)照品，加三氯甲烷制成 1mg/mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液。按 2020 年版《中國(guó)藥典》(四部)通則 0502法[18]進(jìn)行試驗(yàn)：吸取麥冬供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各 6μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254 預(yù)制板上，以石油醚(60 ～ 90℃)- 乙酸乙酯(8∶2，V/V)為展開劑，上行展開，展距為8cm。取出，晾干，置紫外光燈(波長(zhǎng) 254nm)下檢視。

　　1.3.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定

　　1.3.2.1 總灰分、干燥失重、微生物限度測(cè)定按照《中國(guó)藥典》2020 版四部通則 2302 法[18]和 0831 法[18]分別測(cè)定樣品中總灰分和干燥失重，每批樣品平行測(cè)定 2 次，取平均值。按照 GB 4789.2《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[19]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定菌落總數(shù);按照 GB 4789.5《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[20]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù);按照 GB4789.3《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[21]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定大腸菌群;按照 GB4789.4《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》[22]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定沙門氏菌。

　　1.3.2.2 重金屬測(cè)定按照《中國(guó)藥典》2020 版四部通則 2321 法[18]分別進(jìn)行銅、鉛、砷、汞和鎘的含量測(cè)定，每批樣品平行測(cè)定 2 次，取平均值。

　　1.3.3 總黃酮含量測(cè)定稱取約 100mg 川麥冬須根提取物(精確至0.1mg)，置于容量瓶中，加蒸餾水，超聲溶解，定容至 25mL，搖勻，精密吸取儲(chǔ)備液 5mL，加水定容至 25mL，得供試品溶液。精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，置于 25mL 容量瓶中，加 5mL 甲醇溶解，用蒸餾水定容至 25mL，制成濃度為250μg/mL 的對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品和供試品溶液各 4mL 置于25mL 容 量 瓶 中， 加 入 30% 的乙醇溶液 8mL，加入 5% 的亞硝酸鈉溶液 0.7mL，搖勻，放置5min，加入 10% 硝酸鋁溶液 0.7mL，5min 后加入 1mol/L 的氫氧化鈉 5mL，搖勻，用 30% 的乙醇溶液定容，放置 10min。以同批次試劑為空白，按照紫外 - 可見分光光度法(通則 0401)[18]，在 493nm 處測(cè)定吸光度。

　　1.3.4 總皂苷含量測(cè)定取本品粉末 0.1g，置 100mL 容量瓶中，加甲醇 70mL，超聲處理(功率 500W，頻率 40kHz)5min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取魯斯可皂苷元對(duì)照品適量，精密量取，加甲醇制成 50μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液 0.5、1、2、3、4、5、6mL，分別置具塞試管中，于水浴中揮干溶劑，精密加入高氯酸 10mL，搖勻，置熱水中保溫15min，取出，冰水冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，參照紫外 - 可見分光光度法(通則 0401)[18]，在 397nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取供試品溶液 3mL，置 10mL 具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，自“于水浴中揮干溶劑”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中總皂苷含量。

　　1.3.5 麥冬皂苷 D 含量測(cè)定

　　1.3.5.1 供試品溶液的制備 稱取約 100mg 川麥冬須根提取物(精確至 0.1mg)，置于容量瓶中，加蒸餾水，超聲溶解，定容至 25mL，搖勻，精密吸取儲(chǔ)備液 5mL，加水定容至 25mL，即得。

　　1.3.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取麥冬皂苷 D 對(duì)照品適量，置于 25mL 容量瓶中，加甲醇5mL 溶解，用蒸餾水定容，制成濃度為 520μg/mL的對(duì)照品液，搖勻，即得。

　　1.3.5.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Alltima C18(250×4.6mm，5μm); 流 動(dòng) 相∶乙 腈 - 水(52∶48，V/V); 柱 溫：30 ℃;流速：1.0mL/min;漂移管溫度：65℃ ;氣體流速：2.5mL/min;進(jìn)樣量：20μL。分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。

　　1.3.5.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置10mL 容量瓶中，加甲醇定容。按“1.3.5.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度 X(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積 Y 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

　　1.3.5.5 定量限與檢測(cè)限考察 按 2020 年 版《中國(guó)藥典》(二部)中關(guān)于檢測(cè)限與定量下限的要求，將麥冬皂苷 D 自標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度20.8μg/mL 向下逐級(jí)稀釋，按“1.3.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果麥冬皂苷 D 的檢測(cè)限(信噪比為 3)為 0.04μg/mL，定量下限為 0.1μg/mL，可滿足樣品測(cè)定靈敏度要求。

　　1.3.5.6 精密度試驗(yàn) 取麥冬皂苷 D 對(duì)照品溶液，按“1.3.5.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積。

　　1.3.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取川麥冬須根提取物約100mg，精密稱定，按“1.3.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，分別在室溫下放置 0、2、4、6、12、24h，按“1.3.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

　　1.3.5.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取川麥冬須根提取物 6 份，每份約 100mg，按“1.3.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算含量。

　　1.3.5.9 加樣回收率試驗(yàn) 取川麥冬須根提取物 6 份，每份約 50mg，精密稱定，每份中精密加入與樣品中含量等量的麥冬皂苷 D 對(duì)照品，按“1.3.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“1.3.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算其回收率。

　　1.3.5.10 樣品測(cè)定 分別取各批次樣品 100mg，精密稱定，按“1.3.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，每批樣品重復(fù)測(cè)定 2 次。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 薄層色譜鑒別麥冬藥材、川麥冬須根提取物均與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，Rf 為 0.65，而山麥冬藥材無相應(yīng)熒光斑點(diǎn)。

　　2.2 總灰分、干燥失重、微生物限度測(cè)定檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示， 所 測(cè) 10 批樣品總灰分為 0.695% ～ 0.857%，干燥失重為 8.074% ～9.013%;菌落總數(shù)每克均少于 1000 個(gè)，霉菌和酵母菌數(shù)每克均少于 100 個(gè)，大腸桿菌、沙門氏菌均未檢出，所測(cè)樣品均符合《中國(guó)藥典》2020 版及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》的相關(guān)規(guī)定。建議以平均值上浮約 20% 暫定川麥冬須根提取物總灰分不得超過 1%，干燥失重不得超過 11%。

　　2.3 重金屬測(cè)定測(cè)定結(jié)果顯示，銅含量為 15.024 ～ 16.037mg/kg，鉛含量為 0.728 ～ 0.826mg/kg，砷含量為 0.662 ～ 0.815mg/kg，汞含量為 0.073 ～ 0.087mg/kg，鎘含量為 0.166 ～ 0.182mg/kg。所測(cè)樣品均符合《中國(guó)藥典》2020 版及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》的相關(guān)規(guī)定，結(jié)果見表 2。建議以平均值上浮約 20% 暫定銅不得超過 20mg/kg，鉛不得超過1mg/kg，砷不得超過 1mg/kg，汞不得超過 0.1mg/kg，鎘不得超過 0.2mg/kg。

　　2.4 總黃酮、總皂苷含量測(cè)定測(cè)定結(jié)果顯示，總黃酮含量為 9.17 ～ 10.12mg/kg，總皂苷含量為 31.70 ～ 32.99mg/kg，結(jié)果見表 3。建議以最低值下浮約 20% 暫定總黃酮不得低于 8mg/kg，總皂苷不得低于 30mg/kg。

　　2.5 麥冬皂苷 D 含量測(cè)定

　　2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖。結(jié)果顯示，樣品中麥冬皂苷 D的保留時(shí)間約為 6.9min，與其余色譜峰的分離度均大于 1.5，理論板數(shù)以麥冬皂苷 D 計(jì)大于 6000。

　　2.5.2 線性關(guān)系考察麥冬皂苷 D 得回歸方程為 Y=1.7824X+1.573(r=0.9993)，表明麥冬皂苷 D 質(zhì)量濃度在 20.8 ～520μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

　　2.5.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率考察精密度試驗(yàn)結(jié)果：麥冬皂苷 D 峰面積的 RSD為 0.67%(n=6)，表明儀器精密度良好;穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果：樣品中麥冬皂苷 D 峰面積的 RSD 為1.01%(n=6)，表明樣品溶液在室溫下放置 24h內(nèi)穩(wěn)定;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果：樣品中麥冬皂苷 D 的平均含量為 0.308%，RSD 為 1.73%(n=6)， 表明該方法重復(fù)性良好。加樣回收率結(jié)果：麥冬皂苷 D 的平均回收率為 101.584%，RSD 為 2.03%(n=6)，表明方法準(zhǔn)確度良好。

　　3 結(jié)論

　　麥冬指標(biāo)性成分主要為甾體皂苷類和高異黃酮類，而麥冬皂苷 D 作為其主要甾體皂苷之一，與麥冬最新研究報(bào)道的功效密切相關(guān)，故將總皂苷、總黃酮和麥冬皂苷 D 含量共同作為質(zhì)量控制指標(biāo)，與 2020 版《中國(guó)藥典》中麥冬以單一總皂苷含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)相比更為全面，具有較大提升。薄層色譜試驗(yàn)證實(shí)了山麥冬屬植物不含或很少含沿階草屬植物麥冬的特征性成分(高異黃酮類化合物)，同時(shí)可對(duì)山麥冬須根提取物等代用品、混淆品進(jìn)行有效鑒別，保證川麥冬須根原料來源。皂苷類成分極性較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無紫外吸收，并且其測(cè)定經(jīng)常受麥冬多糖的干擾，采用紫外檢測(cè)方法，靈敏度低且有干擾峰，不易測(cè)定，故采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)，利用 HPLC法測(cè)定。

　　基于充分的化學(xué)研究和定性、定量分析，首次建立的川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)，涉及薄層色譜鑒別、檢查(總灰分和干燥失重)，總黃酮和總皂苷的 UV 含量測(cè)定，以麥冬皂苷 D 為指標(biāo)成分的 HPLC 含量測(cè)定。川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)，通過了第三方(綿陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所)的復(fù)核驗(yàn)證，3 批送檢樣品含量測(cè)定結(jié)果在單位之間的 RSD 在 3. 16%以下，表明本研究的檢測(cè)方法準(zhǔn)確方便，重復(fù)性好，標(biāo)準(zhǔn)可行，可為于川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。

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　　作者：何禮 1，金虹 1，*，湯丹丹 1，郭濤 2，黃毅 3，田仁君 1