摘要以中國胡椒主栽品種熱引1號胡椒為材料，設置4個不同濃度氯化鈣(7、14、21、28mmol/L)處理，以去離子水為對照，低溫脅迫4d(10℃/5℃，12h/12h)，恢復培養6d(28℃/20℃，12h/12h)，觀察表型并測定各處理的光合參數、抗氧化酶活性及滲透性物質含量變化情況。

　　結果表明：7mmol/L氯化鈣處理胡椒可以改善寒害表型，隨氯化鈣濃度升高寒害表型逐漸加重;外施7mmol/L氯化鈣能夠顯著改善胡椒的凈光合速率，隨氯化鈣濃度升高，凈光合速率越來越低，氯化鈣濃度過高時(達到28mmol/L)凈光合速率低于CK;與CK相比，外施7mmol/L氯化鈣能夠顯著提高抗氧化酶活性、增加可溶性糖含量、降低丙二醛含量，隨處理濃度升高，抗氧化酶活性和可溶性糖含量越來越低，丙二醛含量越來越高。本研究結果為胡椒生產上抗寒技術指導和抗寒分子育種提供了參考。

　　關鍵詞熱引1號胡椒;氯化鈣;低溫脅迫

　　胡椒(Pipernigurm)是胡椒屬(Piper)多年生常綠藤本植物，素有“香料之王”的美譽，是世界最重要的香辛料作物[1]。中國胡椒主要分布在海南、云南、廣東、廣西和福建等省(區)，種植面積近3萬公頃，年產約3.60萬噸，居世界第五[2]。隨著人們生活水平提高，現在國內胡椒年消費量以20%速度上漲，供需矛盾更加突出。近年來，由于胡椒種植綜合效益高、發展前景好，政府和百姓種植胡椒積極性很高，云南、廣西等省區胡椒種植面積發展迅速[3-4]。

　　栽培種胡椒起源并長期種植于熱帶、南亞熱帶地區，抗寒能力較弱。通過多年田間調查和生理生化指標測定，在栽培胡椒種內未鑒定出抗寒種質。由于我國熱區緯度偏高，寒流等極端氣候頻發，胡椒易遭受寒害，出現掉葉、斷枝現象，傷口又進一步引發病害感染，對胡椒生產造成嚴重影響。生產上胡椒防寒措施主要有越冬前設防風帳或放熏煙堆，寒害后剪除枯枝、噴藥殺菌等，但是這些措施效果有限，災后補救難以減少椒農損失[5-6]。

　　因此，研究如何提高胡椒抗寒性，可為實現胡椒安全越冬、穩定胡椒產業發展奠定基礎。鈣在植物生長過程中起著不可或缺的作用[7]。鈣作為一種信號物質參與細胞內外各種生理活動[8]，具有感知外界環境脅迫和維持細胞膜完整性和選擇性的作用[9]。當植物感知外界環境變化時，細胞內Ca2+濃度會發生特定變化，并引發一系列保護性生理反應[10]。已有研究表明，Ca2+在植物對酸、有毒金屬、干旱、寒冷等適應中發揮著積極作用[11-12]。

　　適量的鈣可以緩解外界脅迫的負面影響。在鹽脅迫下，外源鈣能維持細胞外形促使香蕉幼苗葉片正常，使鹽脅迫傷害得到緩解[13]。在4℃低溫脅迫條件下，外源鈣處理狗牙根中H2O2、O2-和MDA含量顯著低于對照[14]。Zhang等[15]研究發現氯化鈣預處理番茄可以減輕夜間低溫對其的光抑制作用。

　　冀乙萌[16]等研究發現，20mmol/L外源Ca2+處理的木薯幼苗膜傷害率、丙二醛含量降低，SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯胺酸寒含量上升，抗寒性提高效果較明顯，Ca2+濃度過高不利于其抗寒性增強。然而，鈣在胡椒對低溫脅迫反應中的作用還不清楚，鈣是否能減輕低溫對胡椒的危害值得研究。

　　本研究通過不同濃度氯化鈣溶液對低溫脅迫下胡椒抗寒表型和生理指標變化的研究，總結不同Ca2+濃度對胡椒抗寒性的影響，篩選能夠提高胡椒抗寒性的適宜氯化鈣濃度，為今后胡椒抗寒馴化研究和生產應用提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　供試材料為我國主栽品種熱引1號胡椒(Pipernigrumc.v.Reyin-1)，保存于中國熱帶農業科學院香料飲料研究所“農業農村部萬寧胡椒種質資源圃”。熱引1號胡椒插條苗按照農業行業標準“胡椒插條苗”(NY/T360-1999)培育，選取生長正常、無病蟲害和機械損傷的插條，在溫室沙床中培育生根，生根后轉移至育苗袋中撫育3個月，轉移至人工氣候室中進行低溫處理。

　　1.2方法

　　1.2.1試驗設計

　　將供試材料在人工氣候室中培養(28℃/20℃，12h/12h，相對濕度保持在70%左右)，分別設置7mmol/L(T1)、14mmol/L(T2)、21mmol/L(T3)和28mmol/L(T4)4個氯化鈣濃度梯度，以去離子水為對照(CK)，每個處理4株，3次重復。

　　將不同濃度氯化鈣溶液噴施在植株正反兩面葉片上，以滴水為準，剩余溶液灌溉在植株根部，每隔1天噴施1次，共3次。依據王燦等[3]對胡椒寒害氣候等級研究、云南省綠春縣冬季低溫寒潮常出現的低溫情況和吳雪霞[17]等對低溫脅迫及恢復對茄子幼苗的影響，本研究采用的低溫脅迫條件為10℃/5℃(12h/12h)脅迫4天，并恢復培養6天(28℃/20℃，12h/12h)。觀察表型，采集葉片并置于液氮中迅速冷凍，-80℃保存用于測定葉片生理生化變化。

　　利用Li6400型便攜式光合儀分別于氯化鈣處理完成和恢復培養完成時測量植株光合參數(凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Tr)、蒸騰速率(Ci))。測定時間為光照培養5h以后，CO2濃度為(385±5)μmol/mol，測定光強為600μmol/(m2·s)，采用標準葉室，開放式氣路，流速均設定為500μmol/s。

　　1.2.2測定方法

　　采用江蘇科銘生物技術有限公司測定試劑盒分別測定可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、POD、CAT、SOD酶活性、丙二醛含量、脯氨酸含量等生理生化指標，按照說明書操作實驗和計算，每個樣品測定3次重復。

　　1.2.3數據分析

　　所采集數據取3次重復的均值，用SPSS統計分析軟件進行數據分析，多重比較采用Duncan新復極差法，在0.05水平比較差異顯著性。

　　2結果與分析

　　2.1不同濃度氯化鈣對低溫脅迫下胡椒植株表型的影響

　　通過觀察不同濃度氯化鈣對低溫脅迫下熱引1號胡椒表型發現，T1、T2和T3處理植株受害較輕，T1處理植株幾乎沒有寒害表型，T2和T3處理植株部分葉片發黃，穩定葉葉尖有不同程度發黑現象，T4處理植株受害較重，植株表現為嫩葉發黑脫落，部分穩定葉發黃發黑并脫落。CK處理植株受害最為嚴重，植株表現為嫩葉發黑脫落，穩定葉發黑最為嚴重，大部分發黑葉片脫落。說明一定濃度氯化鈣處理可以緩解胡椒寒害表型，以7mmol/L氯化鈣處理胡椒寒害表型最輕。

　　2.2不同濃度氯化鈣對低溫脅迫下胡椒葉片光合參數的影響

　　低溫脅迫前，T1與T2處理的胡椒葉片光合參數與CK無顯著差異;與CK相比較，T3處理中胡椒葉片中凈光合速率有顯著降低(13.51%)，而氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率無顯著降低;T4處理中胡椒葉片中凈光合速率顯著降低了72.97%，且氣孔導度和蒸騰速率也分別顯著降低了83.33%和71.43%。

　　以上結果說明，常溫條件下，外施7mmol/L和14mmol/L氯化鈣溶液對胡椒的光合參數沒有影響，高濃度氯化鈣(高于14mmol/L)處理會抑制顯著胡椒凈光合速率、氣孔導度及蒸騰速率。

　　低溫脅迫條件下，與CK相比，T2和T3處理的胡椒光合參數無明顯差異;T4處理的凈光合速率顯著降低了93.08%，胞間CO2濃度顯著提高了18.41%;T1處理的凈光合速率顯著提高了78.21%，胞間CO2濃度顯著降低了5.56%;以上結果說明，外施不同濃度的氯化鈣對低溫脅迫條件下胡椒的光合參數有不同的影響，外施7mmol/L氯化鈣能夠顯著提高低溫脅迫條件下胡椒的凈光合速率，外施28mmol/L氯化鈣顯著降低了低溫脅迫條件下胡椒的凈光合速率。

　　2.3不同濃度氯化鈣對低溫脅迫下胡椒葉片中Ca2+-ATPase活性的影響

　　細胞受到逆境刺激可導致胞質內Ca2+水平升高，而Ca2+-ATPase可將Ca2+泵出細胞外或鈣庫中，使細胞中的Ca2+維持一定的水平，從而維持細胞正常新陳代謝。胡椒葉片中Ca2+-ATPase酶活性的影響。隨外源鈣濃度的增加，Ca2+-ATPase酶活性呈現先增加后減少的趨勢。

　　與CK相比，T1和T2處理胡椒葉片中Ca2+-ATPase酶活性分別升高52.06%，46.84%，T4處理胡椒葉片中Ca2+-ATPase酶活性降低了14.17%，均無顯著性差異，說明不同濃度的外源鈣沒有顯著性改變胡椒葉片中Ca2+-ATPase酶活性，但是噴施7mmol/L和14mmol/L氯化鈣可以一定程度提高胡椒葉片中Ca2+-ATPase酶活性。

　　2.4不同濃度氯化鈣對低溫脅迫下胡椒葉片SOD、CAT、POD活性的影響

　　不同濃度氯化鈣處理對低溫脅迫條件下胡椒葉片中SOD、CAT、POD活性具有不同的影響，隨外源鈣濃度增加，3種酶活性都呈現先升高后降低的趨勢。與CK相比，T1和T2處理胡椒葉片中SOD活性都顯著性升高了1.56和0.19倍，T3處理胡椒的SOD活性與CK沒有顯著性差異，T4處理使胡椒的SOD活性顯著降低了27.10%。

　　說明噴施一定濃度的氯化鈣(7mmol/L和14mmol/L)可以顯著提高低溫脅迫條件下胡椒的SOD活性，鈣離子濃度增高(28mmol/L)會顯著抑制低溫脅迫條件下胡椒的SOD活性。與CK相比，T1處理胡椒葉片中CAT活性顯著性升高了47.58%，其他濃度氯化鈣處理的胡椒中CAT活性顯著降低或沒有顯著性變化。

　　說明噴施7mmol/L氯化鈣可以顯著提高低溫脅迫條件下胡椒的CAT活性，而增加氯化鈣濃度不能提高。與CK相比，T1、T2、T3和T4處理都可以顯著提高低溫脅迫條件下胡椒葉片中POD活性，分別升高了25.62%、35.51%、25.40%和5.97%，其中T2處理提升效果最明顯，其次是T1和T3。綜合以上結果說明，噴施不同濃度的氯化鈣可以改變SOD、CAT、POD活性，其中噴施7mmol/L氯化鈣提高抗氧化酶活性效果最好。

　　2.5不同濃度氯化鈣對低溫脅迫下胡椒葉片淀粉、可溶性糖含量影響

　　隨外源鈣濃度的增加，胡椒葉片中可溶性糖含量呈現先增加后減少再增加的趨勢，淀粉含量呈現先減少后增加的趨勢。與CK相比，T2和T3處理胡椒中可溶性糖含量沒有顯著性變化，T1和T4處理能夠使胡椒葉片中可溶性糖含量顯著性增加，分別增加了26.03%和27.46%，說明7mmol/L和28mmol/L氯化鈣處理胡椒可以提高可溶性糖含量。

　　與CK相比，T1處理的胡椒中淀粉含量顯著降低(26.06%)，T2和T3處理的胡椒中淀粉含量無顯著性差異，而T4處理胡椒中淀粉含量顯著增加(13.39%)，說明7mmol/L氯化鈣處理胡椒可以降低淀粉含量，而高濃度氯化鈣(28mmol/L)可以提高淀粉含量。

　　2.6不同濃度氯化鈣對低溫脅迫下胡椒葉片丙二醛、脯氨酸含量影響

　　隨外源鈣濃度的增加，胡椒葉片中MDA含量呈現先減少后增加的趨勢，游離脯氨酸含量呈現先增加后減少的趨勢。與CK相比，T1和T2處理胡椒葉片中MDA含量顯著性減少，分別減少了12.40%和11.39%，T3和T4處理胡椒葉片中MDA含量無顯著性差異。說明低溫脅迫下，7mmol/L和14mmol/L氯化鈣處理胡椒可以減低丙二醛含量，而21mmol/L和28mmol/L氯化鈣處理胡椒中無明顯影響。

　　與CK相比，T1和T2處理胡椒葉片中游離脯氨酸含量均顯著性增加，分別增加了25.87%和11.05%，T3和T4處理胡椒葉片中游離脯氨酸含量均顯著性減少，分別減少了18.41%與30.38%。說明低溫脅迫下7mmol/L和14mmol/L氯化鈣處理胡椒可以提高脯氨酸含量，21mmol/L和28mmol/L氯化鈣處理胡椒降低了脯氨酸含量。

　　3討論

　　分析云南和海南胡椒主產區寒潮天氣情況發現，云南主產區冬季經常出現低溫3℃-6℃、高溫10℃-15℃持續2-4天的寒潮，海南主產區部分年份也會出現類似寒潮(如2016年1月);胡椒在寒潮過后幾天內陸續出現寒害癥狀，通過預實驗也發現低溫脅迫后恢復培養4-6天植株寒害癥狀最明顯。

　　因此本試驗在低溫脅迫后恢復培養了6天才取樣測定生理指標。伍寶朵等[18]通過不同溫度(4℃、6℃、8℃、10℃、CK)處理熱引1號胡椒發現，脅迫72h后不同溫度處理均有寒害表型，隨溫度的降低，植株寒害程度逐漸加劇;不同溫度處理POD、CAT、SOD活性均顯著高于CK，10℃脅迫時可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著高于其他處理，脅迫溫度達到4℃時，丙二醛和脯氨酸含量才顯著高于CK。

　　以上可以作為評價胡椒抗寒重要生理指標。此外，鈣不僅作為植物的必需營養元素成為植物細胞的物質組成，而且還是胞外信號和胞內生理反應偶聯的第二信使，可以維持細胞膜的穩定性，在植物生長發育及環境脅迫響應中起著重要作用[10,19]。研究表明，在低溫脅迫下，適宜濃度鈣可以提高植物光合作用、保護酶系統活性等，提高植物抗寒能力[15-16]。

　　因此探討外源鈣對低溫脅迫條件下胡椒光合作用及保護酶活性等生理指標的影響可為胡椒抗寒研究提供參考。光合作用是植物利用光能轉化為化學能，進行同化作用的重要生理過程，也是受低溫影響最顯著的生理過程之一[20-22]。植物凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度及蒸騰速率是光合特性重要參數[23-24]。蒲玉瑾等[25]研究發現，常溫條件下，不同濃度外源Ca2+對降香黃檀葉長凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率均有顯著影響。

　　本研究中，常溫條件下，T1和T2處理胡椒葉片光合作用與對照比沒有顯著變化，當濃度高于21mmol/L時，隨濃度增加，凈光合速率逐漸降低。這與朱曉軍等[26]、張浩[27]等的研究結論一致。研究表明低溫會引起植物凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率同時降低，其中最明顯的就是凈光合速率降低[28]，在凈光合速率降低時，如果胞間CO2濃度也同時降低，說明是因氣孔因素引起了光合作用[29]。

　　如果胞間CO2濃度升高，則說明可能是由光化學活性或RuBP羧化限制等非氣孔因素阻礙CO2的利用，造成CO2積累[30]。同時Ahmad[31]和He[32]等研究表明，外源鈣常通過調節葉片碳同化能力減輕環境脅迫對光合作用的抑制能力。本研究低溫脅迫后，不同氯化鈣濃度處理胡椒的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率較脅迫前有明顯的降低，與CK相比較，T1處理凈光合速率顯著升高，說明一定濃度外源鈣可以減輕低溫脅迫對胡椒光合作用的抑制能力。

　　各處理胞間CO2濃度顯著增高，說明低溫脅迫下胡椒葉片凈光合速率的下降可能是由非氣孔因素引起的。外源鈣對胡椒葉片碳同化能力的影響值得進一步研究。Ca2+濃度變化依賴于質膜或細胞器膜上的Ca2+轉運系統，膜Ca2+轉運系統活躍程度對細胞內Ca2+濃度變化有重要影響。趙明明等[33]研究表明低溫脅迫48h后，抗寒性強的冬青Ca2+沉淀較少，抗寒性弱的冬青Ca2+沉淀較多，細胞器破壞也嚴重。

　　因為細胞內Ca2+的升高是短暫的，完成信使作用后即會撤退，滯留在細胞內會造成Ca2+毒害。本研究中各處理間Ca2+-ATPase活性沒有顯著差異，但是與CK相比，T1和T2處理分別升高了52.06%和46.84%，說明低溫脅迫后，7mmol/L和14mmol/L氯化鈣處理胡椒中出現了短暫的Ca2+升高，為了促使Ca2+及時撤退，Ca2+-ATPase活性升高;T3和T4處理Ca2+-ATPase活性沒有上升或有少量下降，原因可能是外施氯化鈣濃度過高，細胞內Ca2+沉淀較多，對細胞產生了毒害作用。這一觀點需要進一步細胞學實驗驗證。

　　環境脅迫條件下，Ca2+可以激活植物抗氧化途徑，提高抗氧化酶活性，增強保護酶系統清除自由基和活性氧的能力，減輕膜脂的過氧化程度，降低MDA含量[34]。外源5mmol/LCa能夠顯著抑制鎘脅迫下苧麻中H2O2和丙二醛含量、增加超氧化物歧化酶活性及植物干重，顯著減輕苧麻中鎘毒性積累[35]。外源施用Ca有利于優化番茄植株的礦質營養狀況，使番茄植株具有良好的抗氧化能力和耐鹽能力[36]。

　　冀乙萌等[16]發現20mmol/LCa2+濃度處理木薯低溫脅迫下MDA含量最少，保護酶SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量最多。本研究通過不同濃度氯化鈣處理對低溫脅迫條件下胡椒葉片中抗氧化酶活性影響比較發現，低溫脅迫下，外施不同濃度氯化鈣可以改變抗氧化酶活性。與CK相比，T1處理能夠顯著提高3種抗氧化酶活性、增加可溶性糖含量、降低丙二醛含量，隨外源鈣濃度升高，3種抗氧化酶活性和脯氨酸含量越來越低，丙二醛含量越來越高。說明外施7mmol/L氯化鈣激活了胡椒的抗氧化途徑，促使抗氧化酶活性升高，提高了低溫脅迫下細胞清除自由基和活性氧的能力，減輕了膜脂過氧化程度，增強了細胞的滲透勢，降低了MDA含量。

　　在植物組織器官中，淀粉可以被降解形成可溶性糖，參與細胞內的生理生化反應。本研究中T1處理淀粉含量顯著低于其他處理，說明在該處理條件下，淀粉可能被分解成可溶性糖，引起本處理可溶性糖含量的增加。令人疑惑的是，在本研究中發現，T4處理淀粉和可溶性糖含量都顯著高于其他處理，但是除CK外，本處理植株寒害表型最嚴重，這一問題需要進一步的實驗驗證和研究。

　　本研究還發現增加氯化鈣處理濃度并不能改善胡椒抗寒表型及相關指標，原因可能是因低溫脅迫引起了質膜或鈣庫膜鈣離子通道的開啟，大量Ca2+進入胞內，依賴于Ca2+或Ca2+-CaM蛋白激酶或磷酸脂酶被激活，導致細胞骨架蛋白和膜蛋白的磷酸化及膜脂降解，造成細胞骨架與膜結構受到破壞;另外大量Ca2+在細胞核內密集分布也會破壞遺傳物質的合成及表達[37]。

　　因此，下一步應開展Ca2+在細胞內沉淀分析實驗進行驗證。關于外源Ca2+能夠緩解環境脅迫對植物的傷害報道較多，但是不同植物適宜外源Ca2+處理濃度大不相同。外源2mmol/LCa2+可增加南方菟絲子寄生的喜旱蓮子草莖維管束數目，降低莖的節間長、厚角厚度與皮層厚度[38]，而外源60mmol/LCa2+對提高萬壽菊抗寒性效果最佳[39]。

　　在本試驗中，綜合表型和生理指標結果得出，外施7mmol/L氯化鈣是提高胡椒抗寒性的適宜濃度。因此，適宜胡椒Ca2+施用濃度的篩選為生產上增強胡椒低溫抵御能力提供了參考，對促進胡椒在我國適宜種植區的推廣種植及穩產具有重要的意義。

　　參考文獻

　　[1]NairKP.AgronomyandEconomyofBlackPepperandCardamom[M].TheKingandQueenofSpices:Elsevierpress.2011,380.

　　[2]楊建峰,祖超,李志剛,等.胡椒花穗發育過程中葉片不同營養物質動態變化研究[J].熱帶作物學報,2013,34(4):602-606.

　　[3]王燦,楊建峰,陳小敏,等.基于因子分析的胡椒寒害氣象等級研究[J].熱帶作物學報,2015,36(12):2171-2178.

　　[4]張春林,嚴文偉,朱權.綠春縣三猛鄉胡椒種植技術[J].云南農業科技,2018,2:34-35.

　　[5]鄔華松,楊建峰,林麗云.中國胡椒研究綜述[J].中國農業科學,2009,42(7):2469-2480.

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