《構樹葉投喂草魚腸道真菌群落多樣性研究》論文發表期刊：《基因組學與應用生物學》；發表周期：2020年08期

《構樹葉投喂草魚腸道真菌群落多樣性研究》論文作者信息：周本翔 1,2 趙良杰 1,2 彭新亮 1* 1 信陽農林學院水產學院, 信陽, 464000; 2 河南省漁業生物工程技術研究中心, 信陽, 464000 周本翔, 趙良杰, 彭新亮, 2020, 構樹葉投喂草魚腸道真菌群落多樣性研究, 基因組學與應用生物學, 39(8): 3453-3460

　　摘要為研究不同飼料對草魚腸道真菌多樣性的影響，本研究采用高通量測序技術對投喂構樹葉和配合飼料的草魚腸道的真菌多樣性進行比較分析。結果顯示，配合飼料組的真菌群落多樣性高于構樹葉組。真菌序列共聚集成1330個OTU，其中942個OUT可歸入子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)5個門。子囊菌門和擔子菌門是兩實驗組的主要優勢類群。群落結構分析顯示，構樹葉組和配合飼料組腸道真菌群落結構有明顯差異，表明草魚腸道真菌物種組成受到食物改變的影響明顯。

　　關鍵詞 構樹葉，腸道，草魚，真菌

　　Abstract In order to study the effects of different feeds on the diversity of intestinal fungi in grass carp, High-throughput technique was used to analyze the diversity of intestinal fungal community of grass carps fed with Broussonetia papyrifera leaves and formula feed. The results showed that the diversity of fungal community in the compound feed group was higher than that in the Broussonetia papyrifera group. The fungal sequences clustered into 1 330 OTU, and among them, 942 OUT can be classified into five phyla: Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota, Chytridiomycota and Glomeromycota. Ascomycota and basidiomycota were the dominant groups in the two groups. Community structure analysis showed that there were significant differences in the community structure of intestinal fungi between the Broussonetia papvrifera leaves group and the formula feed group, and the species composition ofintestinal fiungi in grass carp was significantly affected by food changes.

　　Keywords Broussonetia papyrifera leaves, Intestinal, Grass carp, Fungus

　　草魚(Cenopharyngodon idellus)屬于鯉形目(Cypriniformes)、雅羅魚亞科(Leuciscinae)、草魚屬(Genopharyngodon)，是中國主要的淡水養殖經濟魚類之一。該魚為草食性，具有生長迅速、易飼養產量高等特點，是中國大宗淡水魚中養殖范圍最廣、產量最大的養殖品種、年產量約占中國淡水魚總產量的20%(畢香梅等，2011)，2017年全國草魚產量達5.3456x109kg草魚為典型的草食性魚類，傳統養殖方式多采用打撈水草或人工種植牧草等青飼料養殖。隨著勞動力成本的上升和飼料工業的快速發展，為追求養殖產量和高效，傳統草魚養殖模式被高投入，高產出的配合飼料養殖模式代替。但利用配合飼料高投入養殖的草魚極易出現病害頻發，肌肉品質下降，口味較差等問題。研究表明，用青飼料飼養的草魚不僅肉質鮮美，氨基酸組成更合理(畢香梅等，2011)，養殖水體的微生物多樣性也顯著高于配合飼料(罩雅，2016)

　　因此，近年來積極提倡多種回歸青飼料的草魚健康養殖模式，并取得了不錯的經濟和生態效益(張德鳳，2018，科學養魚(7)22-3;吳良成等，2013，河南水產，(4)：29-30)

　　構樹葉是一種營養豐富的高蛋白青飼料，蛋白質含量為其干質量的21.30%-22.97%(邳植和沈世華，2018)，構樹葉用于畜禽養殖需要發酵處理才能被較好地吸收利用(李海新，2010;熊羅英等，2012，飼料研究，(5)：51-54)，構樹葉養殖草魚則可直接投喂，經草魚初步消化后的糞便在水中微生物和原生動物的作用下形成生物絮團，不僅能被草魚再攝食利用，也是鏈、鰭、鯉、鯽等濾食性和雜食性魚類的餌料，構樹葉養殖草魚這種簡便且高效的利用方式是畜禽養殖無法達到的。近年來，本項目組一直在進行構樹葉養殖草魚的提質增效技術探索，發現利用構樹葉主養草魚不僅疾病發生少，成活率高，還有效帶動其他魚的生長，可明顯提高產量和效益(周本翔，2018，科學養魚，(6)：79-80)。

　　動物腸道內分布有細菌、真菌、古菌和病毒等大量的微生物，這些微生物在宿主的生長、發育、免疫及營養吸收利用等方面發揮著重要作用，其中真菌是腸道微生物的重要組分，其群落結構組成受食物、品種、藥物、疾病等多因素的影響(朱文華和吳本儼，

　　2017)。研究發現，食物是影響魚類腸道菌群的主要因素之一(Wanget al，2018)。為探討構樹葉對草魚腸道真菌多樣性的影響，本研究選取新鮮構樹葉，并以傳統牧草及配合飼料作為對比，利用高通量測序技術

　　(llumina Miseq")比較研究構樹葉對草魚的腸道真菌群落的組成及多樣性變化的影響，以期為草魚的構樹葉健康養殖提供基礎資料和理論依據。

　　1結果與分析

　　1.1實驗魚的解剖觀察

　　對3組實驗魚進行解剖觀察發現，3個飼料投喂組魚類腸道在投喂1h以上均較為豐滿，充塞度高，表明實驗前期馴食效果良好。觀察發現，經過3周不同飼料的投喂，投喂構樹葉組和牧草組實驗魚體內脂肪含量明顯較少，肝胰臟呈現紫紅色，富有彈性，壓迫無凹陷：投喂配合飼料組實驗魚體內脂肪較多，肝胰臟呈黃白色，彈性較差，易碎。經測量，各組實驗魚體長、體重和空殼重均無明顯差異。

　　1.2真菌高通量測序基本情況對樣品的DNA質檢發現投喂牧草組腸道樣品的總DNA中，真菌DNA含量較低，PCR擴增成功率很低，無法達到實驗要求，因此未對該組樣品進行高通量測序。投喂構樹葉和配合飼料組實驗魚的腸道內含物中PCR檢測到較為豐富的真菌DNA(圖1)，對構樹葉組和配合飼料組實驗魚的腸道真菌多樣性開展測序。測序數據經質控、去除嵌合體和非特異性擴增序列，18個樣品共計獲得1 004470條有效分析序列，經聚類合并共得到1330個操作分類單元(0-

　　TU)分類。

　　1.3多樣性分析

　　通過單樣品的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性。ACE指數和chao1指數均是用來估計群落中含OTU數目的指數，在本研究中是對腸道內含物中真菌群落豐度的反映。可以看出各個樣品中真菌群落的豐度無顯著的規律性，并未因為飼料種類的不同和腸道位置的不同而有明顯的改變。Shannon指數和Simpson指數顯示，配合飼料組的真菌群落多樣性高于構樹葉組。而從腸道位置看，在構樹葉組中1號實驗魚中腸的真菌群落多樣性低于前腸和后腸，另外兩組實驗魚均是中腸的真菌多樣性要高于前腸和后腸。配合飼料組的3尾實驗魚中腸真菌多樣性均低于前腸和后腸。

　　1.4物種組成及優勢類群分析

　　1330個OTU有942個可以歸入子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)以及球囊菌門(Glomeromycota)5個門，其余388個未能確定物種分類歸屬。在可以確定物種的942個OTU中，子囊菌門(Ascomycota)數量最多，共有761個OTU歸入該門，另有145個OTU屬于擔子菌門(Basidiomycota)

　　物種，其他各門物種數量較少，子囊菌門和擔子菌門

　　物種是所有樣品中的主要優勢類群。分別對兩個實驗組的OUT按照相對豐度進行排序，發現配合飼料組草魚腸道內含物比例大于1%的真菌優勢菌群

　　有21個：構樹葉投喂組大于1%的真菌優勢菌群有16個。兩組共同的優勢真菌為4個，分別為皺枝孢

　　(Cladosporium delicatulum)菌株(OTU2 129，OTU2324)

　　一種未知真菌(OTU1857)、散子囊菌目物種Eurotiales sp.(OTU1514)(圖2;表2)。

　　1.5群落結構分析

　　基于群落結構數據進行UPGMA聚類分析、NMDS非度量多維尺度分析、PCoA分析，觀察發現，在上述分析圖中(圖3;圖4;圖5)，G組和s組都自成區域，均可以將兩個飼料投喂組的草魚腸道真菌群落清晰地分開，但是無論在組內還是組間，均不能夠清晰地界定草魚前、中、后腸的真菌群落差異。表明不同真菌群落的多樣性受到了不同飼料投喂的影響而表現出差異性。

　　2討論

　　本研究3組實驗魚經3周不同飼料投喂后，解剖發現，投喂1h后草魚腸道均較為豐滿，充塞度高，說明構樹葉對草魚適口性較好，適合喂養草魚。雖然各組實驗魚體長、體重和空殼重均無明顯差異，但構樹葉組和牧草組與配合飼料組魚的肝胰臟顏色和質地則有明顯差異，構樹葉組和牧草組肝胰臟為紫紅色，富有彈性，壓迫無凹陷，配合飼料組肝胰臟呈黃白色、彈性較差、易碎。

　　肝胰臟作為水產動物新陳代謝最活躍的器官之一，其顏色和質地常作為魚機體健康的重要指標。草魚的肝胰臟營養健康評價標準為：健康草魚的肝胰臟顏色為紫紅色，質地富有彈性，壓迫時無凹陷：不健康草魚的肝胰臟顏色變淡、發白無血色、變黃、變綠、質地差、易碎(劉猛，2013)。根據草魚的肝胰臟營養健康評價標準可知，投喂構樹葉和牧草青飼料有利于保持草魚的健康，而配合飼料則不利于草魚的健康生長。

　　相比腸道細菌，真菌的豐度和多樣性較低且組成不穩定(Heather et al，2015;Suhr et al，2016)，通用引物PCR擴增真菌DNA常出現陰性。本研究對牧草組腸道樣品質檢發現真菌DNA含量較低，PCR擴增無法達到實驗要求，因此未進一步對該組樣品進行高通量測序。對構樹葉和配合飼料組腸道樣品進行測序，Alpha多樣性分析表明，Shannon指數和Simpson指數均顯示配合飼料組的真菌群落多樣性高于構樹葉組。研究發現，健康腸道中真菌菌群所占比例極小，約占黏膜微生物總量的0.02%(Hebuterne et al.，2014)一些真菌會為致病菌的生長提供支持和保護作用，如地絲菌屬可促進沙門氏菌的生長(Wade et al，2003)，白色念珠菌可促進金黃色葡萄球菌生物膜的形成(Harriott and Noven，2009)，腸道中真菌菌群多樣性的增加會增加宿主致病的風險(車媛和李秋榮，2016)，炎癥性腸病腸黏膜真菌的豐度及多樣性較健康腸道明顯升高(Ott et al，200)本研究配合飼料組草魚腸道的真菌多樣性高于構樹葉組，推測投喂構樹葉比配合飼料更有利于草魚的健康生長，這也與草魚肝胰臟營養健康評價標準相一致。對實驗魚前、中、后腸分析顯示，構樹葉投喂組真菌多樣性無明顯的空間變化規律;而在飼料投喂組中，3個樣本中腸的真菌多樣性均低于前腸和后腸。這一結果可能由于構樹葉組的腸道真菌多樣性總體較低，物種豐度有限，因此并未顯示出明顯的規律性;而飼料投喂組真菌多樣性總體較高，處于主要食物消化區域的中腸，由于受到消化液等的影響，真菌的生長受到抑制，多樣性較低。

　　物種組成分析顯示，真菌序列共聚集成1330個OTU，有942個OUT可確定物種分類歸屬，他們可歸入5個門：子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、接合菌門(Zygomycota)以及壺菌門(Chytridiomycota)，其中子囊菌門(Ascomycota)數量最多(761個OTU)，其次為擔子菌門(Basidiomycota)(145個OTU)，兩門真菌是所有樣品中的主要優勢類群，本研究與人(Heather et al.，2015)、馬(邢振存，2016)和雞(溫雪婷等，2019)的腸道優勢真菌組成相一致。對構樹葉組和配合飼料組進行共同優勢真菌菌群分析發現，皺枝孢(Cadasporium delicatulum)菌株(OTU2129，OTU2324)為兩實驗組共同的優勢真菌菌群。有報道顯示，枝孢屬(Cladospori um)一些物種可以產生木質素酶和纖維素酶(靳冉，

　　2012)，在霉樹葉中也分離到該種真菌，該屬另外一些物種還出現在食草動物的糞便中(張中義和孔華忠，2000)。本研究中該種作為優勢種同時出現在兩個實驗組中，推測該種可能與草魚腸道內植物源性碳源的利用有關。

　　基于群落結構的統計分析(聚類分析，NMDS分析和PCoA分析)均顯示構樹葉和配合飼料投喂組腸道真菌群落結構有明顯差異，表明真菌物種組成受到食物改變的影響明顯，通過對腸道真菌群落的分析，可以反映其食物的明顯差異。

　　3材料與方法

　　3.1實驗材料

　　本實驗草魚來自羅山縣小龍山魚類良種繁育場，平均體長規格(14.5+2.9)cm，均為亞成體，實驗用魚體質健康，水族箱中進行訓食反應良好。實驗前，采用膨化顆粒浮性配合飼料飼養5周，將魚隨機分為3組，分別用新鮮構樹葉(G組)、配合飼料(s組)及新鮮牧草(C組)進行訓食，訓食穩定后，分別連續用上述3種飼料飼養3周，不同飼養組魚缸之間養殖用水通過大循環過濾相聯系，以此保證養殖水環境的一致性。養殖實驗3周后，于最后一次投喂后1-2h內，對草魚腸道內含物進行取樣。取樣時，先破壞魚的中樞神經系統處死，對魚進行解剖，觀察魚內臟器官狀態、消化道充塞度等，清理出腸道，并分別截取前、中、后腸取內含物于滅菌離心管中充分混勻，置于-80℃冰箱保存備用。樣品編號為G1-1，G1-2、G1-3分別代表構樹葉組1號魚前腸、中腸、后腸，以此類推。

　　3.2樣品預處理和總DNA提取

　　稱取200 mg的樣品，放入滅菌的2mL離心管中，加入1 mL70%乙醇，震蕩混勻，離心機離心3 min，轉速10000/min，倒去上層液體保留沉淀。加入1x PBS溶液，震蕩混勻，再次在室溫下離心3 min，轉速10 000 rmin室溫離心3min，倒去上層液體保留沉淀。將2mL離心管倒置于吸水紙上，盡量除去液體。將處理后的樣品放入55℃鼓風干燥箱烘干10 min，直至殘留酒精徹底揮發完全，以保證后續實驗操作。采用OMEGA公司生產的試劑盒(型號E.Z.N.AM Mag-Bind Soil DNA Kit)進行草魚腸道內含物樣品總DNA的提取。

　　3.3 ITS序列擴增

　　利用定量檢測試劑盒(型號Qubit 2.0 DNA)對基因組DNA進行精確定量，根據檢測結果確定PCR反應的模板DNA添加量。使用引物ITS1-2通用引物(TTSI引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN

　　(barcode)CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2Rev引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATG)進行第一輪PCR擴增。PCR反應體系：2xTag Master Mix用量為15 uL，正反向引物Bar-PCR primer F(10 umil/L)和Primer R(10 umil/L)用量分別為1uL，模板DNA用量為20 ng，滅菌純水補足，總反應體積為30 L PCR反應條件依次為：94℃持續3min預變性：94℃變性30 s，45℃退火20s，65℃延伸30 s，以上3步執行5個循環：94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30s，以上3步執行20個循環：72℃持續5min終延伸。隨后，使用Ilumina橋式PCR兼容引物進行第2輪PCR擴增。使用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測及純化回收。

　　3.4高通量測序及數據質控

　　采用Miseq測序平臺對擴增文庫進行雙末端測序，對測序得到的結果進行數據質量控制。去除引物接頭序列，將成對的Reads進行配對拼接(Merge)，按照Barcode序列區分樣品進行歸類，通過識別和去除嵌合體以及非特異性擴增等情況，對數據進行過濾和質量控制，最后得到符合分析要求的數據集合。

　　使用Usearch軟件對各樣品序列進行序列相似性比對及操作分類單元(OTU)歸類，后續生物信息統計采用97%相似度水平(屬級)下得到的OUT進行分析。

　　3.5生物學數據分析

　　對各樣本得到的OTU序列進行分類比對鑒定，獲得物種信息。對兩個實驗組的優勢類群和優勢OUT分類單元進行分析，比較各樣品的物種組成情況及差異。采用Chao指數和ACE指數對群落分布豐度進行評價，估計群落中含OUT的數目。采用Shannon index.Simpson index和Coverage指數評價草魚真菌群落分布多樣性(Community diversity)。群落結構采用柱狀圖進行描述，表示各樣品中不同真菌操作分類單元所占百分比。

　　為了解各樣品真菌群落結構的分組相關關系，分別采用UPGMA聚類分析、NMDS非度量多維尺度分析、PCoA分析對群落結構數據進行統計。UP.GMA聚類分析首先利用層次聚類(Hierarchical cluatering)對多樣性距離矩陣進行分析，再進行樹狀結構構建(Unweighted pair group method with arithmetic mean，非加權組平均算法UPGMA)，繪制樹狀圖用于分析：利用樣品中物種組成和豐都等群落信息進行非度量多維尺度分析(NMDS)，繪制二維坐標圖，樣品以點的形式出現在圖上，點之間的相互關系以距離體現，以此來判斷群落間的相似程度。PCoA(Pincipal co-ordinates analysis)是一種研究群落結構差異的可視化降維分析方法，對樣品進行降維后獲取各樣點的主成分因子，利用因子得分得到的特征值在坐標系中對樣點進行空間排序，同樣以點之間的距離關系來分析群落間的相似程度。

　　作者貢獻

　　周本翔負責數據分析和論文撰寫;趙良杰負責樣品處理和實驗工作;彭新亮和趙良杰負責總體實驗設計和研究指導工作。全體作者都閱讀并同意最終的文本。

　　致謝

　　本研究由河南省科技攻關計劃(農業領域)項目(172102110127)和河南省科技攻關項目(182102110081)共同資助資助。

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